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在毕赤酵母中表达康氏木霉(Trichoderma koningii)纤维素酶基因cbhI。提取经诱导的康氏木霉mRNA,通过反转录及PCR反应扩增纤维素酶cbhI基因cDNA。将cbhI基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,采用电激法将经SacⅠ线性化的重组质粒pPICZαA-cbhI转化毕赤酵母GS115,MD及G418抗性平板筛选cbhI基因高拷贝转化子,并用PCR鉴定转化子。BMMY培养基中加入0.5%甲醇对毕赤酵母进行纤维素酶CBHI诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示,表达的重组蛋白相对分子质量约67 kD,pNPC酶活为24.1 U/L,酶蛋白量为0.22 mg/mL,表明,康氏木霉cbhI可以在毕赤酵母中表达,并具有较高活性。 相似文献
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将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。 相似文献
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以马乳酒样乳杆菌ZW3基因组为模板,PCR扩增得到乳糖酶中LacL、LacM两个大小亚基片段,经EcoRI和SnaBI双酶切后,分别连接pPIC9K质粒,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并验证其核苷酸序列正确。将重组质粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM分别电转化毕赤酵母GS115,构建pPIC9K-LacL-GS115重组子和pPIC9K-LacM-GS115重组子,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/mL,具有多拷贝基因的重组子。经反转录PCR验证,cDNA上存在LacL片段,并可检测到乳糖酶酶活达到1.17 U/mL;pPIC9K-LacM-GS115重组子诱导表达72 h后的发酵液上清经SDS蛋白电泳检测到目的条带。 相似文献
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为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl。经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌。用终体积分数1%的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90 000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致。酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高。 相似文献
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对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒是"须向OIE申报的甲壳动物重要疾病"之一。将该病毒主要结构蛋白基因克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPIC9K,构建重组表达载体(命名为pPIC9K-IV),限制性内切酶BglⅡ对其进行酶切线性化,采用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115宿主菌。采用PCR方法分析和G418筛选来鉴定重组的毕赤酵母,诱导表达的产物分别进行ELISA分析或Western blot免疫印迹鉴定,分泌表达产物分子量大小为40ku左右,原核表达时制备的兔抗对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒衣壳蛋白的血清可与真核表达的目的蛋白发生特异性反应。 相似文献
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枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达 总被引:2,自引:2,他引:0
木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性. 相似文献
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在毕赤酵母GS115中表达一种新型食品生物防腐剂——多聚阳离子抗菌肽(poly-cationic antibacterialpeptide,PCAP)。根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成编码多聚阳离子抗菌肽与多聚阴离子肽融合肽的DNA序列,连接并克隆入酵母表达载体pPIC9,得到重组表达质粒pPIC9-PCAP,并转化至毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆子,用体积分数0.5%的甲醇诱导表达,优化表达条件,表达产物用Tricine-SDS-PAGE分析,在分子质量8kD左右处可见目的蛋白表达条带,表明融合肽成功地在毕赤酵母中分泌表达。在pH2.0条件下将表达产物采用胃蛋白酶酶解,分离得到的碱性多聚阳离子肽对食品腐败微生物枯草芽孢杆菌具有明显的抑菌作用。 相似文献
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从人体肾脏组织中提取的总RNA中通过反转录PCR(RT—PCR)扩增得到了ELA2B基因,并将其克隆到pGEM—Teasy载体中。然后用限制性内切酶EcoRI和NotI对重组质粒pGEM—Teasy/ELA2B和毕赤酵母质粒pHC9K进行双酶切,并且通过PCR技术去除ELA2B的信号肽,成功构建了真核表达载体pPIC9K/ELA2B,并将其转入毕赤酵母表达宿主GS115中。得到150株转化子,经含不同浓度G418的YPD平板筛选获得20株高拷贝转化子。甲醇诱导表达后.发酵液上清经SDS—PAGE检测,获得了大小约为28ku的目的条带。通过酪蛋白平板检测发酵液上清,出现透明圈.初步证明获得了有生物活性的弹性蛋白酶。 相似文献