溶氧对L-天冬酰胺酶发酵的影响及其控制

目的 探索溶氧对L-天冬酰胺酶发酵过程的影响及其控制方法。方法 通过装液量试验、接种量试验、葡萄糖试验和氧载体试验,考察摇瓶发酵过程中溶氧对L-天冬酰胺酶合成的影响,采用通纯氧自控pH的发酵工艺进行溶氧控制和pH控制。结果 采用通纯氧自控pH的发酵工艺,可延长发酵周期,有效防止菌体过早自溶,大大促进L-天冬酰胺酶的合成,较分批发酵提高产酶83％,达到110u/ml。发酵动力学特性分析表明,该发酵方式L-天冬酰胺酶的合成与菌体生长不相关,控制比生长速率μ为0.15～0.301/h,均有利于L-天冬酰胺酶的合成,可使Qp_(max)达到3922mmol/g.h。结论 溶氧对大肠杆菌L-天冬酰胺酶的合成有严重影响,已建立了控制溶氧的发酵工艺。     

乙醇脱氢酶的初步分离及其酶学性质的研究

以硫酸铵为沉淀剂,采用盐析法对乙醇脱氢酶（ADH）进行了初步的分离纯化,ADH比活力从粗酶液的0.464 U·mg^-1提高到1.198 U·mg^-1,纯化倍数为2.582。研究了ADH的基本酶学性质,其最适作用pH值为7.0-10.0,pH值为8.0时酶活力达到最大,pH值为7.0时酶较为稳定;最适作用温度为37℃,温度为30-40℃时酶活力较为稳定,温度超过45℃后酶活力急剧下降。     

洗涤剂用复合酶的配伍性能研究

研究了由碱性蛋白酶,碱性纤维酶,淀粉酶复配而成的复合酶温度和pH特性,以及合成洗衣粉中常用表面活性剂和各种助剂对它的作用。结果表明,该复合酶最适反应温度为40℃,最适pH为10．0,在温度20℃－60℃,pH4－12及在洗涤剂各组分的实际洗涤浓度范围内均具有良好的稳定性,且与洗衣粉各成分配伍性良好。     

果胶酶不同组分的酶学性质研究

对黑曲霉(A．niger)果胶酶的三个组分进行了分离。研究了它们的酶学性质。研究表明聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)、果胶酯酶(PE)硫酸铵分级沉淀的浓度分别为60％～100％、30％～90％、50％～90％。最适作用温度分别为45℃、50℃、50℃，最适作用pH值分别为4．0、6.0、6．0。同时研究了三个组分的热稳定性和pH值稳定性。     

苦瓜多肽的分离纯化研究

以苦瓜为原料分离纯化制备多肽,通过正交试验确定了酶解的最佳工艺条件:加酶量为4%,温度45 ℃,酶解时间为1 h,料液比为2,多肽得率提高19.7%.采用葡聚糖凝胶G-50纯化得到2组洗脱液.此分离纯化工艺简单可行,成本低,可适用于工业化生产.     

高效降解氰化物菌株的分离及酶法降解条件

从自然界分离到一株真菌，能高效降解工业合氰废水中的氰化物。经鉴定，该菌株为串珠镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）。并对该菌株的降解条件进行了研究，氰化物降解酶的最适诱导物浓度为３０ｍｇ·Ｌ－１，降解作用的最适ｐＨ为８．０，最适温度为３０℃。     

酸性蛋白酶AP-10分离纯化及其酶学性质

采用活性炭吸附脱色、硫酸铵分级沉淀、脱盐和凝胶层析等技术对酸性蛋白酶AP-10浓缩液进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。结果表明,分离纯化后得到的酸性蛋白酶AP-10纯组分比酶活为5 800 U·mg^-1,纯化倍数为6倍;最适反应温度为40℃,热稳定范围为30～45℃;最适反应pH值为3.0,pH值稳定范围为3.5～6.5;Mn²⁺对酸性蛋白酶AP-10具有强烈的激活作用,Fe²⁺对酸性蛋白酶AP-10具有强烈的抑制作用。为拓展酸性蛋白酶AP-10的应用及开发高品质产品奠定了基础。     

杂色云芝漆酶的分离、纯化和酶学特性研究

杂色云芝发酵液,经超滤、DEAE-Sephadex A250柱层析两步分离、纯化出两型漆酶。以愈创木酚与酶带在适当条件下反应呈棕红色谱带鉴定出漆酶谱带。两型漆酶分别命名为LacA和LacB。经测定两漆酶亚基的分子量分别为66.0kDa和30.7kDa;等电点pI分别为4.79和5.18;LacA的最适作用温度是40℃,LacB为50℃;保温2h, LacA的半失活温度为60℃,LacB为90℃;LacA和LacB催化愈创木酚的酶活最适pH值均为4.0; 二者的稳定pH值也都在2.5~5.5之间。LacA催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为286.5molL-1和292.4nmol mL-1 min-1;LacB催化氧化愈创木酚的Km和Vmax分别为813.0mol L-1和127.4nmol mL-1 min-1。     

枯草杆菌碱性磷酸酶制备的最佳工艺条件及酶促反应动力学性质的研究

以枯草杆菌为菌种液体培养制备碱性磷酸酶，研究确定了培养的最佳工艺条件，并对碱性磷酸酶的酶促反应动力学性质进行了初步探讨。结果表明，枯草杆菌制备碱性磷酸酶的最佳工艺条件为：40℃，pH值7．4振荡培养10h，酶活最高。对碱性磷酸酶的动力学性质研究表明，该酶催化底物磷酸苯二钠水解反应的最适pH值8．8，最适温度52℃，米氏常数Km值为2．94mmol／L。     

固定化细胞延胡索酸酶性质的研究

探讨了海灌酸钠固定化普通变形杆菌延胡索酸酶的性质。研究结果表明：酶催化延胡索酸为Ｌ－苹果酸的最适温度为４０℃，最适ｐＨ为７．０。在温度低于４０℃和ｐＨ５。０～８．０的条件下，固定化细胞酶活力稳定性好，显示其热稳定性和ｐＨ稳定性明显优于游离细胞。Ｃｙｓ对固定化细胞酶活力无影响，ＧＳＨ对前激活作用。     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵及表达产物的纯化

目的 研究重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵和表达产物的纯化工艺。方法采用最适基质浓度、pH、溶氧量、培养温度等发酵表达条件及产物提纯方法。结果 菌体密度A6000达40.8,表达量达160mg/L。提纯的bFGF回收率为40％,生物学活性（ED50）为 0.21ng/mL,比活性达4.76×106U/mg,其纯度、分子量、残余DNA等各项检测结果均符合“重组 DNA制品质量控制要点”。结论 为hbFGF工业化生产和临床应用提供了依据。     

重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体纯化条件的优化

目的优化重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件。方法将表达Gp41的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎、洗涤分离提取包涵体,以不同pH值的低浓度变性剂溶解包涵体,稀释复性并用离子交换层析纯化目的蛋白,纯化产物经West-ernblot进行鉴定。结果以50mmol/LTris buffer、2mol/L,pH11.5尿素溶解的包涵体蛋白得到很好的溶解,目的蛋白复性得率大于40%。经纯化后,目的蛋白的纯度大于90%,且具有良好的反应原性。结论优化了重组HIV-1跨膜蛋白Gp41包涵体的纯化条件,为HIV-1Gp41抗原纯化工艺的放大提供了依据。     

治疗用质粒DNA的纯化工艺

目的探索适合大规模生产治疗用质粒DNA的纯化工艺。方法采用中空纤维柱收菌、碱裂解,再应用中空纤维柱浓缩质粒,经分子筛、亲和、离子交换等层析分离纯化质粒DNA,并应用凝胶电泳、PCR、核酸蛋白检测仪、BCA蛋白检测试剂盒和内毒素检测试剂盒对所纯化的质粒DNA进行全面检定。结果所获得的超螺旋质粒DNA达到样品总质粒的91.2%;质粒DNA总纯度为1.8;内毒素含量小于10EU/mg;几乎检测不到蛋白质残留,未检出基因组DNA残留。各项指标均符合有关质量标准。结论所采用的纯化工艺省时省力,制备的质粒DNA纯度高,适用于大规模生产治疗用质粒DNA。     

疏水作用层析在重组大肠杆菌表达的rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化中的作用

目的建立rProEMAPⅡ/P43蛋白的纯化工艺,明确疏水作用层析(HIC)在纯化中的作用。方法采用由疏水作用层析、离子交换层析、亲和肝素层析组成的工艺对rProEMAPⅡ/P43蛋白进行纯化,并与由离子交换层析和亲和肝素层析组成的工艺相比较,分别进行总蛋白含量测定、SDS-PAGE分析目的蛋白含量及纯度检测。结果在pH为7·4~7·5时,采用HIC方法纯化的蛋白较不采用HIC法回收率提高了28·4%,纯化后rProEMAPⅡ/P43蛋白纯度为92%。结论在rProEMAPⅡ/P43蛋白纯化过程中增加疏水作用层析,可以提高rProEMAPⅡ/P43蛋白收率。     

重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵

目的建立重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用摇瓶及发酵罐培养工程菌BL21/pBV221-rhBMP-7,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响。在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A600值达100时,42℃升温诱导,并对表达产物进行纯化。结果发酵培养基与LB培养基培养的工程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;最适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;最佳诱导时间为3h。以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,最终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上。结论已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺。     

人LNα4链LG3-4组件的优化表达及活性检测

目的优化人层粘连蛋白α4链LG3-4组件基因在大肠杆菌中的表达条件。方法分别从诱导温度、诱导时间、IPTG浓度等方面进行优化。表达产物经Ni-NTA介质纯化,MTT法检测目的蛋白对人肺癌A549细胞粘附及增殖功能的影响。结果在20℃下,1mmol/L的IPTG诱导6h,目的蛋白呈最佳可溶性表达;在37℃下,2mmol/L的IPTG诱导4h,呈最佳包涵体形式表达。纯化后目的蛋白纯度达96%,且具有良好的增强人肺癌A549细胞伸展和粘附的功能。结论已确立了hLNα4LG3-4重组蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件。     

HCV C区基因片段的克隆、表达及纯化

目的研究 ＨＣＶ Ｃ区片段在大肠杆菌中的表达及纯化工艺。方法采用 ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＣＶ感 染者血清中克隆Ｃ区基因片段,插入ｐＥＴ２８ａ（＋）质粒中,并在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达。采用亲和层析或 Ｓａｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－２００柱层析纯化抗原。结果两种纯化工艺的收率分别为５８ｍｇ／Ｌ和９５ｍｇ／Ｌ发酵液。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示纯 度分别为９８％和９０％。ＥＬＩＳＡ检测纯化抗原具有较好的抗原性和特异性。结论两种纯化工艺简便,重组蛋白纯 度高,可用于ＥＬＩＳＡ试验。     

重组蜂毒素-基因变构IL-2的纯化与生物活性

目的制备纯化重组蜂毒素-基因变构IL-2(Melittin-88ArgIL-2)嵌合蛋白,并检测其生物活性。方法将含表达载体的大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达。表达产物经离子交换层析与亲和层析进行纯化,SDS-PAGE鉴定,MTT染色法检测嵌合蛋白对Hela细胞增殖的抑制作用。结果所表达的可溶性蛋白,纯化后纯度达95%,蛋白浓度0.5g/L。纯化后的嵌合蛋白在体外能抑制Hela细胞的增殖。结论已成功地制备并纯化了重组melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白,该蛋白具有生物活性,为中试放大和纯化工艺研究奠定了基础。     

Characterization and application of a recombinant dopa decarboxylase from Harmonia axyridis for the efficient biosynthesis of dopamine

Here,a dopa decarboxylase (DDC) from Harmonia axyridis was heterogeneously expressed in Escherichia coli for the efficient biosynthesis of dopamine.For the production of recombinant DDC,the cultivation conditions including IPTG concentration,temperature and induction time were optimized and obtained an optimal specific enzyme activity of 51.72 U·mg-1 crude extracts.After the purification of DDC with a recovery yield of 68.79％,its activity was further characterized.The Vmax,Km,Kcat,and Kcat/Km of DDC for dihydroxyphenylalanine (dopa) were 0.02 mmol·ml-1·s-1,2.328 mmol·ml-1,10435.90 s-1 and 4482.77 ml·mmol-1·s-1,respectively.The highest DDC activity was observed at the condition of pH 7.5 and 45 ℃.With the purified DDC,the feasibility to produce dopamine from L-dopa was evaluated.The optimal yield was determined at the following bioconversion conditions:pH of 7.0,the reaction temper-ature of 40 ℃,0.4 mmol·L-1 of PLP and 4 g·L-1 of L-dopa.Subsequently,a fed-batch process for the pro-duction of dopamine was developed and the effect of oxygen was evaluated.The titer,yield and productivity of dopamine reached up to 21.99 g·L-1,80.88％ and 14.66 g·L-1h-1 at 90 min under anaer-obic condition.