约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究

通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25（217AA）和Pys48（455AA）,以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。     

家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV的RBD蛋白及其免疫原性研究

利用杆状病毒表面展示技术,构建展示SARS-CoV的棘突蛋白（spike protein）受体结合结构域（receptor binding domain,RBD）的重组杆状病毒vBmgp64-RBD,并进一步研究其展示目的蛋白的免疫原性。结果表明：RBD蛋白正确表达并成功展示在病毒囊膜表面,将灭活的纯重组杆状病毒vBmgp64-RBD皮下注射BALB/c小鼠能产生抗RBD蛋白的特异性抗体,且抗体具有抗RBD蛋白的中和作用。证明vBmgp64-RBD有可能作为一种基于杆状病毒的新型SARS疫苗,为SARS的体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础。     

家蚕杆状病毒表面展示SARS-CoV的RBD蛋白及其免疫原性研究

利用杆状病毒表面展示技术,构建展示SARS-CoV的棘突蛋白(spike protein)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)的重组杆状病毒vBmgp64-RBD,并进一步研究其展示目的蛋白的免疫原性。结果表明:RBD蛋白正确表达并成功展示在病毒囊膜表面,将灭活的纯重组杆状病毒vBmgp64-RBD皮下注射BALB/c小鼠能产生抗RBD蛋白的特异性抗体,且抗体具有抗RBD蛋白的中和作用。证明vBmgp64-RBD有可能作为一种基于杆状病毒的新型SARS疫苗,为SARS的体外检测及后续疫苗的研究开发奠定了基础。     

基于RD-BmBacmid载体构建表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法

研究构建一种快速表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法。在复制缺陷型的家蚕杆状病毒(BmNPV)穿梭载体RD-BmBacmid基础上,利用PCR方法合成两端分别含有50bp左右同源臂的绿色荧光蛋白基因(AcGFP)片段和线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞或家蚕幼虫,可以一步获得重组病毒,表达绿色荧光蛋白。实验结果表明,含有AcGFP基因的重组杆状病毒构建成功,在BmN细胞和家蚕幼虫中分别表达了绿色荧光蛋白。因而,本研究成功建立了一种快速构建重组杆状病毒并能够表达GFP蛋白的新方法。     

双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗免疫原性及中和效价的测定

在Balb/c小鼠模型上,评价双佐剂新型冠状病毒灭活疫苗的免疫效果及中和抗体水平.新型冠状病毒经Vero细胞培养、收获、浓缩、灭活、纯化等一系列步骤,制成灭活疫苗原液,以不同的配方剂量添加CpG佐剂和氢氧化铝佐剂后,免疫Balb/C小鼠,然后检测小鼠血清特异性抗体水平及中和抗体效价水平.结果表明:低、中剂量新冠抗原添加低、中剂量的CpG佐剂后,可以有效地提高S蛋白特异性抗体效价水平及中和抗体效价水平,效果远大于单独铝佐剂组;但CpG剂量如果过高,会有抑制效果.添加CpG佐剂后,可以使新冠病毒灭活抗原在较低的剂量下,就能产生较高水平的S蛋白特异性抗体效价及中和抗体效价.     

利用GST融合多肽制备人源膜受体多抗的研究

膜受体是一类膜蛋白,而全长的膜蛋白很难通过基因工程获得,这给制备该类蛋白的抗体增加了难度。为了探索一条制备膜受体多克隆抗体的新途径,通过基因重组技术,将膜受体的抗原决定簇与GST标签进行融合表达,然后免疫新西兰兔,获得了相应的多克隆抗体。结果表明,利用融合GST的多肽进行抗体制备的方法是可行的。     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区（命名为Kago2）,构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区(命名为Kago2),构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

以羊肚菌菌丝为抗原的不同免疫程序对Balb/c鼠抗体水平的影响

以羊肚菌菌丝为抗原,免疫Balb/c鼠。用建立的酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法检测不同免疫剂量、不同免疫途径、不同免疫次数等免疫程序影响因素所对应的免疫Balb/c鼠的血清抗体水平,得出产生抗体水平较高的快捷的免疫程序。结论：70μg∕只剂量的不含佐剂的羊肚菌菌丝抗原,经由腹腔间隔4d连续3次注射的免疫程序,可以在首免的25d后产生较高水平的抗体。     

家蚕天然Hemolin蛋白原核表达

Hemolin蛋白是一种类免疫球蛋白,属于昆虫的一种重要的先天性免疫球蛋白,家蚕(Bombyx mori)Hemolin蛋白与其他昆虫的序列具有高度的同源性,为了进一步分析家蚕Hemolin蛋白的功能,以杆状病毒感染的家蚕蚕蛹为原料,通过抗体亲和层析获得高纯度的天然Hemolin蛋白。结果表明:重组表达菌株pET-32a-hemolin经终浓度为0.1 mmol/L IPTG低温诱导后可在大肠杆菌BL21中成功表达;通过镍离子金属螯合亲和层析并经200 mmol/L咪唑洗脱可以获得较纯的重组Hemolin蛋白;免疫新西兰大白兔产生特异性多克隆抗体通过蛋白A亲和层析柱纯化后可获得高纯度的Hemolin抗体,并经抗体亲和层析获得的天然Hemolin蛋白纯度高,可用于对Hemolin蛋白功能的进一步研究。文章提供的分离纯化高纯度家蚕天然Hemolin蛋白的方法能够推进天然免疫蛋白的纯化,为进一步研究家蚕天然Hemolin蛋白的晶体结构、蛋白质抑菌功能以及抗病毒活性奠定基础。     

自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体的纯化与检测

为了提纯并鉴定自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体,探讨其在部分组织中的免疫定位．首先合成带谷胱甘肽转移酶标签的自噬基因融合蛋白,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗体浓度,最后用免疫亲和纯化方法提纯抗血清中的多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测抗体效价,蛋白印迹检测抗体特异性及在组织中的表达情况．结果表明：制备得到自噬基因融合蛋白重组多克隆抗体经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其质量浓度为每10μL含5μg,用酶联免疫吸附法显示此抗体效价及特异性较高,蛋白印迹显示蛋白大小为55kD左右．     

家蚕表达重组人乳铁蛋白及产物对溃疡性结肠炎的治疗作用

乳铁蛋白（LF）在抗炎和参与机体免疫调节方面具有重要作用。利用家蚕杆状病毒表达系统构建含人乳铁蛋白（hLF）基因的重组病毒Bm-hLF,接种蚕蛹表达重组人乳铁蛋白（rhLF）,ELISA法检测rhLF的表达量,体外抑菌试验检测其抑菌活性,并建立小鼠溃疡性结肠炎（UC）模型,探究口服rhLF蚕蛹粉对UC的治疗效果。结果表明：rhLF在蚕蛹感染重组病毒120h后表达量最高达0.38mg/mL蚕蛹匀浆上清液;rhLF蚕蛹粉能抑制E.coli TG1的生长;口服rhLF蚕蛹粉可明显降低UC小鼠的疾病活动指数（DAI）、髓过氧化物酶（MPO）含量,减轻结肠组织炎症损伤,为今后开发一种新型、廉价的UC口服药物提供药效学实验参考。     

家蚕表达重组人乳铁蛋白及产物对溃疡性结肠炎的治疗作用

乳铁蛋白(LF)在抗炎和参与机体免疫调节方面具有重要作用。利用家蚕杆状病毒表达系统构建含人乳铁蛋白(hLF)基因的重组病毒Bm-hLF,接种蚕蛹表达重组人乳铁蛋白(rhLF),ELISA法检测rhLF的表达量,体外抑菌试验检测其抑菌活性,并建立小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型,探究口服rhLF蚕蛹粉对UC的治疗效果。结果表明:rhLF在蚕蛹感染重组病毒120h后表达量最高达0.38mg/mL蚕蛹匀浆上清液;rhLF蚕蛹粉能抑制E.coli TG1的生长;口服rhLF蚕蛹粉可明显降低UC小鼠的疾病活动指数(DAI)、髓过氧化物酶(MPO)含量,减轻结肠组织炎症损伤,为今后开发一种新型、廉价的UC口服药物提供药效学实验参考。     

赭曲霉毒素A的抗原设计及在免疫分析中的应用

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一种重要的生物毒素,其广泛存在于谷物和其他植物性食品中。食品中的OTA残留进入人体后会对健康造成危害。为快速便捷地对OTA进行检测,本文以OTA为原料,设计合成了结构更加合理的新的OTA半抗原(OTA-H1),制备了OTA的完全抗原(OTA-H1-BSA, OTA-H1-OVA),并进行了小鼠免疫实验,建立了OTA间接竞争酶联免疫分析法(ic-ELISA)。采用核磁氢谱、核磁碳谱和高分辨质谱对OTA半抗原结构进行表征,结果表明半抗原结构正确;利用OTA-H1-BSA作为免疫抗原免疫Balb/c小鼠,小鼠血清效价为8 000,表明该免疫抗原对OTA具有一定的抑制作用;利用以OTA-H1-OVA作为包被抗原建立的间接竞争酶联免疫分析法检测小麦样品时,IC₅₀为0.04 ng/mL,灵敏度较原有方法提高了30倍。本方法可用于小麦样品中OTA的快速检测。     

家蚕MBP-Bmlp7蛋白的克隆表达及免疫学鉴定

克隆表达家蚕蚕蛹30 kD(1 kD=1 u)脂蛋白家族成员Bmlp7(Bombyx mori lipoprotein 7)的融合蛋白,鉴定其致敏原性.合成Bmlp7的基因后连接至载体质粒p MAL-C5e上,在大肠杆菌BL21中诱导表达出麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)-Bmlp7,纯化后,利用Western blot鉴定MBP-Bmlp7融合蛋白与家蚕过敏患者血清中特异性免疫球蛋白E(immunoglobulins E,Ig E)的结合能力.结果显示,纯化得到了纯度较高的MBP-Bmlp7融合蛋白,且该融合蛋白能够与家蚕过敏患者血清特异性IgE结合,说明Bmlp7是家蚕中一种潜在的致敏原.     

抗氨甲酰化蛋白抗体的制备及其ELISA检测方法的建立

为了制备抗氨甲酰化蛋白抗体,探讨了氨甲酰化与瓜氨酸化之间的关系,开发氨甲酰化蛋白检测试剂盒。以牛血清白蛋白(BSA)和氰酸钾(KCNO)为原料合成人工完全抗原(Hcit-BSA),然后免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,获得抗血清,间接ELISA测定抗体效价,用方阵实验确定抗体最佳稀释倍数和包被抗原的最佳包被浓度,间接竞争ELISA检测抗体特异性。结果表明:抗体效价大于1∶8 000,抗体最佳稀释倍数为1∶4 000,包被原最佳包被浓度为0.25μg/mL,抗体能特异性识别氨甲酰化产物(carbamylation-derived products,CDPs)。Hcit-BSA具有较强免疫原性,使BALB/c小鼠产生抗氨甲酰化蛋白抗体,也为建立一种简便、快速、特异性强的免疫分析方法奠定了基础,为一些疾病的早期快速检测提供了可能。     

β-伴大豆球蛋白鼠源多克隆抗血清的制备及其免疫学特性鉴定

用抗原免疫动物获取血清是常规的抗体制备方法。β-伴大豆球蛋白作为大豆蛋白中最主要的致敏蛋白之一,制备相关抗体是建立其免疫学快速检测方法的基础。将提取的天然β-伴大豆球蛋白与弗氏佐剂混合,乳化后皮下多点注射Balb/c小鼠,每3周加强免疫1次,免疫后第10天对所制备多抗血清的免疫学特性进行鉴定。结果表明,5次免疫后6只小鼠多抗血清效价均达1∶6 400以上,其中6号小鼠的多抗血清敏感性最强,其半数抑制浓度IC50为718 ng·mL-1。此多抗血清与芝麻蛋白、麦胚球蛋白无交叉反应,与花生蛋白、大豆球蛋白交叉反应率低于10%。本试验成功制得了效价高、敏感性强、特异性好的鼠源多抗血清。     

鼠源抗AFB1噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

研究以AFB1-BSA免疫的小鼠脾脏细胞为试验材料,利用RT-PCR技术,克隆了抗AFB1抗体重链和轻链可变区基因VH和VL,利用连接肽（Gly4Ser）3将VH和VL链接成单链抗体基因scFv,通过噬菌体展示载体pCANTAB-5E携带将其电转化E.coli TG1,经氨苄青霉素平板筛选,构建了库容为2.13×10^9 cfu/μg DNA的噬菌体单链抗体库,抗体库的克隆阳性率达到100%,且多样性良好,为高活性抗AFB1单链抗体的筛选提供了材料基础。     

人源性rhG-CSF单链抗体基因的克隆和表达

从构建的噬菌体表面展示文库中，筛选出全新的人源抗重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）特异单链抗体（ScFv）的噬菌体克隆。ScFv被克隆到pCANTAB 5E载体上，以E. coli TG1为宿主，进行噬菌体表面呈现，以rhG-CSF为靶抗原进行免疫亲和富集筛选，经酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定，得到一株高亲和力克隆。DNA序列分析表明，该ScFv基因全长733 bp，其中重链可变区（VH）为366 bp，轻链可变区（VL）为322 bp。抗rhG-CSF的ScFv在E. coli HB2151中以可溶形式分泌表达，产物主要分布于周质中，占周质总蛋白的质量分数为20%～25%，经免疫印迹试验（Western-blot）分析显示该单链抗体黏均分子量为31 kD。     

受人工免疫启发的脚本病毒检测模型

为了检测日益增多的脚本病毒变种,提出了一种基于人工免疫原理的脚本病毒检测模型。该模型借鉴了人工免疫的自体耐受和克隆选择机制,将脚本代码提呈为抗原,用抗体模拟病毒检测环境下的检测器,按照免疫学习机制对抗体进行分类,模拟了否定选择算法,避免抗体识别正常抗原,利用抗体的自学习机制发现有害的变种抗原,通过对成熟抗体和记忆抗体进行演化,建立了抗体的动态产生与淘汰机制,从而降低误检率。仿真实验表明,该模型能有效检测脚本病毒变种,为脚本病毒的检测提供了一条新途径。