天花粉蛋白抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长及逆转syk基因甲基化的研究

目的:研究天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和诱导细胞凋亡过程中脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,syk)基因甲基化状态的改变,以寻找新的去甲基化药物.方法:采用MTT法分析TCS对MDA-MB-231细胞增殖的影响,Giemsa染色法观察TCS作用后细胞形态学的变化,FCM检测不同浓度TCS作用48 h后MDA-MB-231细胞凋亡和细胞周期分布情况,甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法检测MDA-MB-231细胞经TCS作用前后syk基因甲基化状态的改变,RT-PCR方法分析TCS作用后MDA-MB-231细胞中syk、Dnmts和MBD2 mRNA表达量的变化,比色法检测TCS对MDA-MB-231细胞DNA甲基转移酶活性的影响.结果:TCS体外对MDA-MB-231细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.05),并呈时间和浓度依赖性;TCS可诱导MDA-MB-231细胞出现空泡样变性、核固缩和核碎裂等细胞凋亡形态学改变,能使MDA-MB-231细胞凋亡并可诱导细胞生长周期阻滞,凋亡率明显高于对照组(P<0.05),并呈时间和浓度依赖性.TCS可以逆转MDA-MB-231细胞syk基因启动子区甲基化状况;MDA-MB-231细胞syk mRNA表达阴性,经TCS作用后,syk mRNA表达阳性;MDA-MB-231细胞经TCS作用48 h前后Dnmts和MBD2 mRNA表达量没有明显变化(P>0.05),但Dnmts活性降低.结论:TCS在抑制MDA-MB-231细胞增殖、诱导细胞凋亡过程中对syk基因具有明显的去甲基化作用,因而可能成为新型的去甲基化药物.     

Aurora-B激酶特异性抑制剂AZD1152-HQPA对人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞的抑制作用

目的探讨激光（Aurora）-B激酶特异性抑制剂AZD1152-HQPA对人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞的抑制作用。方法用不同浓度的AZD1152-HQPA（0、10、50、100、500 nmol.L-1）体外作用于人骨肉瘤细胞株U2-OS24、48、72 h,采用噻唑蓝（MTT）检测AZD1152-HQPA对人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞的抑制作用;采用Western Blotting检测AZD1152-HQPA作用于人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞前后Aurora-B激酶的表达情况。结果 AZD1152-HQPA对人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞生长抑制作用明显,且抑制呈时间-浓度依赖性。50 nmol.L-1AZD1152-HQPA作用24、48、72 h,人骨肉瘤细胞株U2-OS细胞中Aurora-B激酶的表达随作用时间的延长而降低。结论 AZD1152-HQ-PA能抑制U2-OS细胞生长,并且抑制作用呈时间-浓度依赖性。     

小鼠肺组织中肿瘤坏死因子α水平的变化与真菌机会性感染的关系

目的探讨小鼠肺组织中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平的变化与肺组织真菌机会性感染的关系。方法将70只小鼠按数字表法分为2组：A组25只和B组45只。B组小鼠腹腔注射环磷酰胺（Cyclophosphamide,CY）80 mg.kg-1.d-1,A组小鼠腹腔注射等量的生理盐水。2组于8、24、48 h杀死小鼠,分离肺组织。Western Blot法检测2组小鼠肺组织胞浆中TNF-α的表达;比色法检测肺组织中髓过氧化物酶（My-eloperoxidase,MPO）的活性。A组小鼠注射无菌生理盐水24 h后、B组小鼠腹腔注射CY后8、24、48 h分别鼻吸入烟曲霉菌孢子,各组小鼠分别在感染24、96 h处死,匀浆肺组织培养,计数菌落数。结果 B组CY处理后8、24、48 h肺组织TNF-α水平分别为0.152±0.011、0.314±0.029和0.631±0.035,显著低于A组小鼠肺组织中TNF-α水平（0.812±0.043）（P〈0.01）。B组3个时间点的TNF-α水平比较差异有统计学意义（P〈0.01）。B组小鼠8、24、48 h肺组织中MPO活性均显著低于A组[（0.028±0.007）、（0.075±0.004）、（0.125±0.009）U.g-1vs（0.218±0.015）、（0.208±0.036）、（0.211±0.012）U.g-1,均P〈0.01]。A组烟曲霉菌菌落数在24、96 h时均显著低于B组（均P〈0.01）。结论小鼠肺组织TNF-α表达下调,降低了肺组织MPO活性水平,导致抗感染天然免疫抑制,是机体发生机会性真菌感染的机制之一。     

1400W对缺氧培养人舌鳞癌CAL-27细胞株iNOS的影响

目的探讨缺氧条件培养下诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）抑制剂1400 W对人舌鳞癌CAL-27细胞株iNOS的影响。方法常规培养人舌鳞癌细胞系CAL-27后,实验组分别加入iNOS抑制剂1400W 50（50μmol.L-1组）、100（100μmol.L-1组）、200（200μmol.L-1组）、400（400μmol.L-1组）μmol.L-1的培养液缺氧条件下培养;对照组不加iNOS抑制剂1400 W培养液缺氧条件下培养。在缺氧条件下培养24、48、72、96 h后,采用硝酸还原酶法检测细胞培养上清液NO含量。结果 1400 W作用于人舌鳞癌CAL-27细胞后,实验各组细胞培养上清液NO含量与对照组比较明显下降（P〈0.05）,并且随作用时间和剂量的增加而相应递减。结论选择性iNOS抑制剂1400 W可显著抑制缺氧条件下培养的人舌鳞癌CAL-27细胞株iNOS的表达。     

扶正消癌合剂对人肺腺癌A549细胞作用研究

目的:研究扶正消癌合剂对肺腺癌A549细胞增殖的影响及PI3K/Akt信号通路的作用机制。方法:制备大鼠含药血清,采用CCK8法对A549进行观察,了解其增殖抑制情况,了解其对细胞周期的影响,以及如何造成细胞凋亡。利用Western-Blot法检测含药血清对PI3K,Akt及P-Akt蛋白表达产生的作用。结果:扶正消癌合剂能抑制A549细胞增殖,呈现时间-浓度依赖关系,与顺铂呈正相关,48 h、72 h、96 h的抑制率分别是28.26%、39.62%和37.89%;扶正消癌合剂可以促进A549细胞发生变化,出现凋亡的情况,并且随着浓度的增高而有所增加,镜下观察G2/M期细胞明显增多,所占的比例也相应增加,相对于另一组来说差异有统计学意义(P<0.05)。其在诱导过程中,随着细胞逐渐凋亡,下调PI3K、P-Akt蛋白表达。结论:扶正消癌合剂可以抑制人肺腺癌细胞A549增殖,可能与抑制PI3K/Akt信号通路中PI3K、P-Akt蛋白表达有关。     

人血清白蛋白诱导人肾小管上皮细胞对Egr-1表达的影响

目的:探讨人血清白蛋白对人肾小管上皮细胞Egr-1表达的影响。方法:将人肾小管细胞培养至90%~98%融合时随机分为A、B、C、D四组,其中,A组为正常组,B、C、D组为药物组,并分别给予不同浓度(0、10、20、40 mg/m L)的人血清白蛋白共培养,各组分别于24、48、72 h收集细胞,并应用免疫印迹检测Egr-1表达水平。结果:与A组比较,各时间段Egr-1表达均有不同程度升高,其中24 h D组Egr-1蛋白相对表达、48及72 h C、D组Egr-1蛋白相对表达均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05),其他药物组差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:人血清白蛋白刺激可呈剂量和时间依赖性上调人肾小管细胞表达Egr-1。     

SGX523对舌鳞癌 Tca8113细胞增殖与 c-Met 表达的影响

目的：体外观察 SGX523对舌鳞癌细胞株 Tca8113中 c-Met 的表达情况及细胞增殖的影响。方法实验分为2组：对照组（Tca8113＋DMSO）；SGX 组（Tca8113＋不同浓度范围30～600 nmol· L－1的 SGX523）。采用Western blotting 检测不同浓度的 SGX523作用下的 Tca8113细胞中 c-Met、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和 AKT的表达情况，MTT 法检测不同浓度的 SGX523对 Tca8113细胞作用24、48、72 h 后细胞增殖的抑制率。结果与对照组相比，SGX 组在相同时段的 Tca8113细胞的增殖抑制率明显增加（P ＜0．01），表明 SGX523对 Tca8113细胞的增殖抑制作用具有浓度依赖性。在相同浓度（100 nmol·L－1）SGX523作用下，24、48、72 h 的半数抑制率 IC50分别为（60．31±7．11）、（26．71±4．54）、（7．87±4．92）nmol·L－1，组间比较差异有统计学意义（P ＜0．01），表明SGX523对 Tca8113细胞的增殖抑制作用有时间依赖性。对照组细胞抑制率在24、48、72 h 差异均无统计学意义（均 P ＞0．05）。Western blotting 法检测结果显示不同浓度 SGX523的 SGX 组 c-Met、MAPK 和 AKT 蛋白表达都明显下调，与对照组比较差异有统计学意义（均 P ＜0．05），且不同浓度 SGX523的 SGX 组间比较差异有统计学意义（P ＜0．01）。结论SGX523具有以浓度和时间依赖性方式抑制 Tca8113细胞增殖和下调 c-Met 蛋白表达作用，是一种有前景的舌鳞癌治疗的药物。     

丹参素在大鼠肝脏低温保存中对HO-1表达的影响

目的检测丹参素（Salviamiltiorriza Bunge,SB）或锌原卟啉（ZnPP）预处理的大鼠肝脏中血红素氧合酶-1（HO-1）的表达,研究丹参素对HO-1表达和肝脏病理改变的影响。方法将72只SD雄性大鼠随机分成A、B、C3组,每组24只。A组灌注保存液为乳酸林格液（LR）,B、C组为SB（300 mg·kg^-1）＋LR,A、B组大鼠在制模前24 h用生理盐水5 mL行腹腔注射。C组在制模前24 h用ZnPP（1.5 mg·kg^-1）腹腔注射。建立大鼠肝脏低温灌注保存模型,在保存0、1、3、6 h后,RT-PCR检测各组大鼠肝脏HO-1 mRNA表达的情况,光镜观察肝细胞形态改变。结果①B组大鼠肝脏HO-1 mRNA表达水平明显比其他2组高（均P〈0.01）。②B组肝脏病理评分明显优于其他2组（均P〈0.01）。病理评分和HO-1的表达呈负相关（r=-0.816,P〈0.01）。结论丹参素灌注保存液可以诱导大鼠肝脏中HO-1的过表达,对肝脏低温保存起保护作用。     

ERK通路抑制剂对白蛋白诱导人近端肾小管上皮细胞细胞外基质合成的影响

目的 探讨细胞外信号调节激酶（ERK）通路抑制剂对人血清白蛋白诱导人近端肾小管上皮细胞细胞外基质（ECM）合成的影响.方法 将体外培养的人近端肾小管上皮细胞株HK-2细胞按是否加入干预剂分为4组：A组（空白对照组）、B组、C组和D组.A组不加入任何干预剂.B组加入人血清白蛋白5 g·L-1.C组加入ERK1/2信号通路的特异抑制剂PD98059 10 μmol·L-1.D组加入ERK1/2信号通路的特异抑制剂PD98059 10 μmol·L-1 预处理45 min.预处理后,再加入人血清白蛋白5 g·L-1.各组细胞均放置水套式CO2培养箱培养0、12、24和48 h.培养0、12、24和48 h后收取细胞,用于MMP-9、TIMP-1和col-ⅣmRNA及蛋白的检测.应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测4组0、12、24和48 h时MMP-9、TIMP-1和col-ⅣmRNA表达水平.ELISA法检测4组0、12、24和48 h时MMP-9、TIMP-1和col-Ⅳ蛋白表达水平.结果 B组、D组12、24 h时MMP-9、TIMP-1和col-Ⅳ mRNA及蛋白表达水平均显著高于A组（均P＜0.01）,48 h时MMP-9、TIMP-1和col-Ⅳ mRNA及蛋白表达水平均显著低于A组（均P＜0.01）;D组12、24和48 h时MMP-9、TIMP-1和col-Ⅳ mRNA及蛋白表达水平均显著低于B组（均P＜0.01）,MMP-9、TIMP-1和col-Ⅳ mRNA及蛋白表达水平均显著高于0 h（均P＜0.01）.结论人血清白蛋白可能通过ERK通路作用于HK-2细胞,促进ECM的合成和抑制ECM的降解,诱导ECM积聚,从而参与肾小管间质纤维化.     

犀黄丸提取液对MDA-MB-231乳腺癌细胞功能的影响

目的:研究犀黄丸提取液对MDA-MB-231乳腺癌细胞功能的影响。方法:采用CCK-8法检测犀黄丸提取液对细胞半抑制浓度(IC50)和细胞活力的影响;采用流式细胞技术检测细胞凋亡;transwell法检测细胞转移能力;采用克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果:犀黄丸提取液干预细胞72 h的IC50值为15.08 g·L~(-1);以15.08 g·L~(-1)的犀黄丸提取液干预细胞72 h后,相对未加药组,其细胞活力显著下降(P<0.01),早期凋亡和晚期凋亡均显著升高(P<0.01),细胞迁移和增殖能力均显著下降(P<0.01)。结论:本研究从细胞水平上证实了犀黄丸具有显著促进细胞凋亡、抑制细胞增殖、转移和降低细胞活力的能力。     

NF-κB在高糖诱导“代谢记忆”致心肌细胞损伤的作用机制

目的探讨代谢记忆损伤心肌细胞的分子机制。方法体外培养20只SD大鼠乳鼠心肌细胞,每组5只,分为4组：持续低糖组、持续高糖组、代谢记忆组和PDTC组。计算细胞凋亡指数,免疫组化检测核内NF-κB的表达,Western Blot检测NF-κB蛋白,TUNEL检测细胞凋亡。结果代谢记忆组蛋白表达水平（15.12±2.32）和持续高糖组的（17.10±3.12）均较持续低糖组（5.23±2.13）的NF-κB核内蛋白水平显著升高（P〈0.01）,PDTC预处理后,NF-κB核内蛋白水平（7.12±2.41）较代谢记忆组（17.10±3.12）显著降低（P〈0.05）;同时,代谢记忆组（19.42±3.22）和持续高糖组（22.36±3.45）凋亡指数较持续低糖组（8.56±0.23）有明显的增加（P〈0.05）,而PDTC组（10.33±1.34）较代谢记忆组心肌细胞凋亡指数（19.42±3.22）有明显降低（P〈0.05）。结论 PDTC能抑制代谢记忆中所致的心肌细胞的损伤,NF-κB的激活可能介导了高糖诱导的代谢记忆所致的心肌细胞的损伤。     

NF-κB 介导热休克蛋白 70 减轻大鼠急性坏死性胰腺炎的实验研究

目的：探讨热休克蛋白70（heat shock protein 70,Hsp70）减轻大鼠急性坏死性胰腺炎的机制。方法将60只 SD 大鼠按随机数字表法分为3组,每组20只。A 组急性坏死性胰腺炎（aute nicrosis apoptonisis,ANP）模型由5％牛黄胆酸钠大鼠胰胆管逆行注射诱发而成,B 组手术进腹后翻动十二指肠,C 组使用温生理盐水持续腹腔灌洗30 min,10 h 后同 A 组造 ANP 模型。于最后1次手术后6 h 处死大鼠,检查各组大鼠血清细胞因子 IL-6、TNF-α和 IL-8及血清淀粉酶;取胰腺组织行病理检查,并分别使用 PCR 和免疫组织化学方法检测胰腺中 Hsp70和 NF-κB 的表达。结果C 组大鼠血清淀粉酶为（2845．70±204．78）U·L^-1,明显低于 A 组的（4064．93±188．97）U· L^-1,高于 B 组的（1221．47±54．58）U·L^-1（均 P ＜0．05）;C 组大鼠血清 TNF-α、IL-6、IL-8明显低于 A 组,高于B 组（均 P ＜0．05）;C 组大鼠胰腺组织 Hsp70 mRNA RQ 值明显低于 A 组,但高于 B 组（P ＜0．05）;NF-κB 在胰腺中的表达：A 组部分细胞核强阳性染色,胞浆中弱阳性染色,B、C 组细胞核染色明显减弱,胞浆则未见染色。结论HSP70可以通过调控 NF-κB 从而下调细胞因子的表达,进而改善大鼠 ANP 病理生理。     

EPO对阿霉素所致心衰大鼠氧化应激能力及细胞凋亡水平的影响

目的评价红细胞生成素（EPO）对阿霉素所致心力衰竭大鼠氧化应激和细胞凋亡水平的影响,并探讨其抗心力衰竭的可能机制。方法30只SD大鼠随机分为EPO组、心衰组和对照组（予相同体积生理盐水）,每组10只。采用腹腔注射盐酸阿霉素（ADR）建立心衰大鼠模型,EPO组每日给予EPO50U·kg-1;心衰组每日给予相同体积生理盐水,观察10周。第11周行心脏超声检测并测定大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平及心肌组织中FasmRNA的表达,Tunel法测心肌细胞凋亡。结果与心衰组相比,EPO组左室射血分数显著提高、MDA及FasmRNA的水平降低、心肌细胞凋亡指数（AI）减少、SOD活力增加（均P〈0．01）;与对照组相比,心衰组大鼠SOD活力下降、MDA水平升高、FasmRNA的表达及心肌细胞AI指数增加（均P〈0．01）。结论EPO能显著减轻阿霉素诱导的血流动力学障碍、改善心功能,且此作用可能与氧化应激能力及细胞凋亡水平降低有关。     

浅蓝菌素对人成骨肉瘤细胞U2-OS在裸鼠体内生长抑制的作用

目的研究浅蓝菌素（cerulenin）对人成骨肉瘤细胞U2-OS在裸鼠体内生长抑制作用。方法建立人成骨肉瘤细胞U2-OS BALB/C裸鼠瘤模型。18只成瘤裸鼠按随机数字表分成3组,每组6只;对照组（DMSO溶剂）、低剂量cerulenin组（0.2 mL cerulenin配制液40 mg.kg-1.次-1）、高剂量cerulenin组（0.2 mL cerulenin配制液80 mg.kg-1.次-1）于腹腔隔日注射连续6次。动态观察3组肿瘤体积及裸鼠质量变化,用药结束后18 d处死裸鼠,测量瘤重、计算瘤重抑制率,测量肿瘤体积、计算肿瘤体积抑制率。肿瘤组织行形态学观察。TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况。结果高、低剂量cerulenin组肿瘤体积抑制率分别为51.2%和24.2%,瘤重抑制率分别为49.1%和25.5%。各组间瘤体体积与瘤重比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。瘤体组织学显示cerulenin组较对照组出现明显的细胞凋亡的超微结构改变,瘤细胞体积较小,多数细胞微绒毛消失,胞质密度增高。TUNEL法显示高、低剂量cerulenin组,对照组癌细胞凋亡率为（17.1±1.2）%、（10.3±0.8）%、（3.5±0.5）%,3组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 cerulenin能够有效诱导人成骨肉瘤细胞U2-OS在裸鼠体内凋亡,抑制肿瘤的生长。     

miR-148a / b 真核表达质粒的构建及其在胰腺癌细胞系中的表达简

目的构建miR-148a／b真核表达质粒,转染胰腺癌AsPC-1细胞,并观察其miR-148a／b的表达水平。方法根据miRBase提供的序列合成miR-148a／b前体,PCR扩增后形成双链,插入线性化真核表达质粒pcDNA3．1,构建pcDNA3．1／miR-148a／b,进行酶切和测序鉴定。将胰腺癌AsPC-1细胞分4组进行质粒转染：转染pcDNA3．1／miR-148a（miR-148a组）、转染pcDNA3．1／miR-148b（miR-148b组）、转染pcDNA3．1（空质粒对照组）和仅加脂质体（空白对照组）。转染48h后,采用定量PCR法检测各组细胞中miR-148a／b的表达量。结果pcDNA3．1／miR-148a／b的酶切和测序与miRBase提供的序列完全一致。转染48h后,miR-148a组AsPC-1细胞中的miR-148a表达量明显高于空质粒对照组和空白对照组（6．76±0．35比1．00±0．54、1．02±0．40,均P〈0．05）,miR-148b组AsPCq细胞中的miR-148b表达量明显高于空质粒对照组和空白对照组（3．28±0．08比1．02±0．35、1．01±0．28,均P〈0．05）。结论成功构建了miR-148a／b真核表达质粒pcDNA3．1／miR-148a／b,该质粒能显著上调胰腺癌AsPC-1细胞的miR-148a／b表达水平。     

奥沙利铂对人Burkitt-Raji细胞生长抑制与凋亡的影响

目的观察奥沙利铂对人Burkitt-Raji细胞的生长抑制和凋亡作用。方法将浓度为0、6.25、12.5、25、50、100μg.mL-1的奥沙利铂与人Burkitt-Raji细胞分别作用24、36、48 h,用CCK-8法检测奥沙利铂对人Burkitt-Raji细胞的生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期的变化、检测细胞凋亡率,用免疫组化的方法检测奥沙利铂对人Bur-kitt-Raji细胞ki-67蛋白、bax蛋白的影响。结果奥沙利铂对人Burkitt-Raji细胞有生长抑制、促凋亡作用,其对人Burkitt-Raji细胞的生长抑制率随药物浓度和作用时间的增加而增大,流式细胞仪分析显示奥沙利铂将人Bur-kitt-Raji细胞阻滞于G2/M期。奥沙利铂浓度为100μg.mL-1作用48 h,Raji细胞生长抑制率为（94.73±1.40）%,Raji细胞的早期凋亡率为（8.25±1.79）%、晚期凋亡和继发坏死率为（14.61±2.18）%。结论奥沙利铂能够抑制人Burkitt-Raji细胞的增殖,可诱导人Burkitt-Raji细胞发生一定的凋亡。     

人血清白蛋白对HK-2细胞col-Ⅳ、TIMP-1、MMP-9mRNA表达水平的影响

目的探讨人血清白蛋白对体外培养的HK-2细胞Ⅳ型胶原（Ⅳcollagen,col-Ⅳ）、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）mRNA表达水平的影响。方法 HK-2细胞随机分为4组。A组细胞（空白对照组）,未添加刺激物;B组、C组和D组细胞分别与5 mg.mL-1人血清白蛋白培养12、24、48 h。在0、12、24、48 h应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测col-Ⅳ、TIMP-1和MMP-9 mRNA的相对表达量。结果人血清白蛋白刺激HK-2细胞可上调col-Ⅳ、TIMP-1 mRNA的表达,且随着刺激时间延长,表达水平逐渐增高。B、C、D 3组HK-2细胞col-Ⅳ、TIMP-1mRNA表达水平均明显高于A组（均P〈0.01）。人血清白蛋白刺激HK-2细胞,MMP-9 mRNA的表达随着刺激时间的延长,表达水平先增高后下降。B、C 2组HK-2细胞MMP-9 mRNA表达水平均明显高于A组（均P〈0.01）,D组HK-2细胞MMP-9 mRNA表达水平低于A组（P〈0.05）。相关性分析结果显示,TIMP-1 mRNA表达与col-ⅣmRNA表达呈正相关（r=0.987,P〈0.05）,MMP-9 mRNA表达与col-ⅣmRNA表达无关（r=0.146,P〉0.05）。结论人血清白蛋白刺激HK-2细胞可能通过促进col-Ⅳ的合成及上调TIMP-1、下调MMP-9使细胞外基质积聚,参与肾间质纤维化。