酶法分离制备γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸

以L-谷氨酸(L-G lu)和L-天冬氨酸(L-Asp)两种混合酸性氨基酸〔m(L-G lu)∶m(L-Asp)=1∶1〕为原料,利用大肠杆菌菌体内脱羧酶对L-谷氨酸的专一脱羧作用,酶法分离制备了γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸。考察了转化体系温度、pH等影响L-谷氨酸脱羧酶活力的主要因素,实验表明,最佳工艺条件为:温度35℃,转化体系pH=5.0,ρ(菌体)=6 g/L,ρ(Tween80)=0.15 g/L,菌龄16 h,ρ(底物)=60 g/L。L-谷氨酸脱羧酶在最适转化条件下比酶活高达15 036 U。1 g湿菌体可重复使用3次共转化L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物30 g,其中L-谷氨酸完全转化为γ-氨基丁酸。γ-氨基丁酸及L-天冬氨酸的总收率可分别达到理论收率的88%和90%。     

天冬氨酸酶基因工程菌固定化细胞制备L-天冬氨酸合成条件优化

以反丁烯二酸和氨水为原料,采用天冬氨酸酶基因工程菌固定化细胞生物催化法合成L-天冬氨酸。通过响应面法考察反丁烯二酸浓度、温度、p H对合成L-天冬氨酸的影响。结果表明,固定化天冬氨酸酶基因工程菌合成L-天冬氨酸最佳条件为:底物反丁烯二酸的质量浓度为300 g/L,反应温度为37℃,底物p H为7.5,L-天冬氨酸的产率为96.7%。固定化细胞可连续使用10批次。通过电镜观察发现天冬氨酸酶基因工程菌均匀分布于载体,天冬氨酸酶基因工程菌固定化细胞具有良好的稳定性。     

重组酪氨酸脱羧酶酶学性质

酪氨酸脱羧酶能以L-酪氨酸为底物脱羧生成酪胺。该文利用pET28a为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了短乳杆菌来源的酪氨酸脱羧酶,并研究了其酶学性质,考察了起始pH、温度、辅酶、底物浓度等因素对酶活的影响。结果表明,酪氨酸脱羧酶重组表达成功,酶促反应工艺为:在1 mL转化液中含有0.18 g L-酪氨酸,0.02 g湿菌体,0.2 mol/L的醋酸缓冲溶液和0.2 mmol/L的5'-磷酸吡哆醛,40℃,pH=5.5,反应7 h,L-酪氨酸的摩尔转化率达到99%。酪氨酸脱羧酶酶活为29.2 U/g,Km值和Vmax为0.71 mmol/L和9.31mol/(L·min·g)。     

色氨酸酶重组基因表达及其酶法合成L-色氨酸

为实现色氨酸酶高效、低成本催化合成L-色氨酸,利用p ET30a为载体在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中重组表达了产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的色氨酸酶,以丙酮酸、吲哚和氨为底物,探究其酶学性质,考察了反应温度、起始p H、底物摩尔比对酶促反应的影响,并利用丙酮酸发酵液为底物酶法合成L-色氨酸。结果表明,色氨酸酶重组表达成功,色氨酸酶最佳反应条件为:温度35℃,起始p H=9.0,底物摩尔比n(吲哚)∶n(丙酮酸)=0.6∶1,底物丙酮酸浓度为0.17 mol/L。利用重组色氨酸酶全细胞催化100 m L浓度为0.57 mol/L丙酮酸发酵液,流加浓度为4.27 mol/L吲哚酒精溶液6.5 m L,反应28 h后,L-色氨酸浓度达0.25 mol/L,吲哚摩尔转化率达91.8%。     

重组酪氨酸脱羧酶酶学性质研究

酪氨酸脱羧酶能以L-酪氨酸为底物脱羧生成酪胺。本文利用pET-28a为载体在宿主细胞E. coli BL21(DE3)中重组表达了短乳杆菌来源的酪氨酸脱羧酶,并研究了其酶学性质,考查了起始pH、温度、辅酶、底物浓度等因素对酶活的影响。结果表明,酪氨酸脱羧酶重组表达成功,酶促反应工艺为：在1 mL转化液中含有0.18 g的L-酪氨酸,0.02 g湿菌体,0.2 M的醋酸缓冲溶液和0.2 mM的5'-磷酸吡哆醛,40℃,pH 5.5反应7 h,L-酪氨酸的摩尔转化率达到99%。酪氨酸脱羧酶酶活为29.2 U/g,Km值和Vmax为0.71 mM和9.31 mol/L?min?g。     

重组L-苏氨酸醛缩酶催化合成L-4-硝基苯基丝氨酸

利用pGEX-KG载体在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达了L-苏氨酸醛缩酶,以4-硝基苯甲醛、甘氨酸为底物酶法合成了L-4-硝基苯基丝氨酸,考察了反应温度、pH、底物摩尔比和甘氨酸浓度对酶活的影响。最佳转化条件为：反应温度45℃,pH=8.0,甘氨酸与4-硝基苯甲醛底物摩尔比5:1,底物甘氨酸最适浓度为500 mmol/L;0.1 g湿细胞菌体在10 mL反应体系中在最佳反应条件下反应24 h,底物4-硝基苯甲醛转化率为43%,产物L-4-硝基苯基丝氨酸达到9.72g/L,总收率为35%。     

双酶连续催化生物合成D-丙氨酸

建立了天冬氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶双酶连续催化制备D-丙氨酸的方法。利用天冬氨酸消旋酶全细胞催化L-天冬氨酸消旋得到DL-天冬氨酸,离心去除天冬氨酸消旋酶全细胞后升温灭活残留的游离天冬氨酸消旋酶,再加入经镍柱亲和纯化的D-氨基酸转氨酶酶液,催化D-天冬氨酸(D-Asp)和丙酮酸(PA)经转氨反应生成D-丙氨酸。经单因素实验得到天冬氨酸消旋酶最佳催化条件为:反应温度40℃,0.2 mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH=7.0),底物L-天冬氨酸质量浓度为100 g/L。D-氨基酸转氨酶最佳催化条件为:反应温度42℃,0.2 mol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.0),4 mmol/L磷酸吡哆醛,DL-天冬氨酸质量浓度为50 g/L,底物n(PA)∶n(D-Asp)=1∶10。转化产物经等电点结晶和阳离子树脂分离得到D-丙氨酸。在该条件下,D-天冬氨酸转化率达94%,D-丙氨酸收率为84%,对映体过量值(ee值)=98%。     

天冬氨酸转氨酶法制备L-4-氟苯丙氨酸的研究

利用重组大肠杆菌(E.coliBL21-pET/aspC)所产天冬氨酸转氨酶立体选择性地催化转化对氟苯丙酮酸(FPPA)生成L-4-氟苯丙氨酸(FPhe)。优化了转化条件,实验结果表明,最佳转化条件:温度37℃,pH值范围5.0—8.0,菌体用量为菌体与FPPA质量浓度比为5.5(菌龄8 h),吐温80的质量分数为0.6%,FPPA的质量浓度7.08 g/L,L-天冬氨酸与FPPA摩尔比为1.6。在最适条件下,经过12 h酶转化反应基本完成,FPPA转化率达到90%以上,FPhe得率达到85%以上,为FPhe的制备提供了一种新方法。     

双酶级联生物合成D-赖氨酸

建立了氨基酸消旋酶和赖氨酸脱羧酶双酶级联高效生产D-赖氨酸的方法。利用氨基酸消旋酶全细胞催化消旋L-赖氨酸得到DL-赖氨酸,去除氨基酸消旋酶后再加入赖氨酸脱羧酶,将消旋产物中的L-构型脱羧生成1,5-戊二胺和CO2,剩下D-赖氨酸;最终,通过阳离子交换树脂吸附洗脱得到D-赖氨酸。经考察双酶级联催化的最佳条件为:反应温度40℃,0.2 mol/L磷酸钾缓冲溶液(p H=5.8),底物L-赖氨酸质量浓度为50 g/L,氨基酸消旋酶全细胞和赖氨酸脱羧酶全细胞质量浓度均为10 g/L,4 mmol/L磷酸吡哆醛,0.1 g/L Triton X-100,反应时间12 h,其中消旋反应2 h和脱羧反应10 h,最终D-赖氨酸收率达42%,对映体过量值(e.e.值)=98%。     

双酶偶联生物合成L-酪氨酸

多酶偶联催化是酶法制备手性药物中间体的重要方法之一。该文采用双酶偶联体系,利用天冬氨酸转氨酶全细胞催化L-天冬氨酸转氨至苯丙酮酸,生成L-苯丙氨酸,同时得到中间产物丙酮酸;反应体系中的酪氨酸酚裂解酶全细胞催化丙酮酸、苯酚和氨酶法合成L-酪氨酸。经考察确定了双酶偶联反应的最佳条件为:温度40℃,pH=8.5,底物苯丙酮酸质量浓度为25 g/L,苯丙酮酸与L-天冬氨酸摩尔比1∶1.2,天冬氨酸转氨酶与酪氨酸酚裂解酶细胞质量比1∶1,4 mmol/L PLP,0.1 g/L吐温80。30 g/L的氯化铵对双酶偶联反应有促进作用。双菌双酶偶联生物法合成L-酪氨酸,充分利用了反应副产物丙酮酸得到附加值较高的产品,对资源合理利用及绿色合成工艺具有参考意义。     

组成型天冬氨酸转氨酶基因工程菌的构建与高效表达

天冬氨酸转氨酶AspAT是苯丙酮酸转氨制备L-苯丙氨酸的关键酶. 本研究将大肠杆菌中天冬氨酸转氨酶基因aspC克隆到3种不同质粒中，构建组成型表达质粒pUC/P-aspC, pSE/P-aspC, pET/P-aspC，并分别转化至6种常用的大肠杆菌宿主中. 通过对18种重组子的生长及产酶情况的分析，比较了各种重组子生长压力、质粒稳定性与表达酶活的关系，并经SDS-PAGE电泳分析AspAT的表达量，筛选出高产AspAT的重组子BL21(pET/P-aspC)，以该工程菌发酵液直接作为酶液，以天冬氨酸和苯丙酮酸(20 g/L)为底物，发酵液与底物以1:3的体积比转化生成L-苯丙氨酸16.2 g/L，转化率高达80.1%. 该体系表达无需诱导，转化无需添加辅酶PLP，展现了良好的产业化前景.     

异源表达酮还原酶的重组菌单羰基还原1,2-环己二酮

利用表达糖多孢红霉菌聚酮合成酶模块1的酮还原酶的重组大肠杆菌细胞Escherichia coli BL21(p ET-ery KR1)2对1,2-环己二酮进行了催化还原反应,该还原反应为单羰基还原而非双羰基还原,生成的产物为2-羟基环己酮。对重组细胞催化1,2-环己二酮还原的反应条件进行了优化,发现最优的反应条件为底物浓度20 mmol/L,细胞密度80 g/L,p H 6.0,转速120 r/min,温度37℃,且需要添加10 g/L E.coli BL21(p ET-gdh1)辅酶再生系统和0.2 mmol/L NADPH。在该反应条件下,重组菌催化反应10 h后,底物的转化率可高达84.2%。     

重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸

利用重组色氨酸合成酶催化合成L-5-羟基色氨酸,采用单因素以及响应面分析方法考察了p H、反应温度、底物浓度和底物摩尔比对L-5-羟基色氨酸合成的影响。最佳转化条件为:反应温度为32℃,p H=8.6,5-羟基吲哚与工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.1∶1,底物工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸最适合浓度为180 mmol/L,反应平衡时间为18 h,工业角蛋白水解氨基酸液中L-丝氨酸摩尔转化率达到86.5%。     

酶法转化制备L-瓜氨酸

利用粪链球菌精氨酸脱亚胺酶转化L-精氨酸制备L-瓜氨酸。考察了菌龄、转化温度等多种因素对精氨酸脱亚胺酶活力的影响。酶法制备L-瓜氨酸的最适工艺条件是:菌体发酵时间20 h,转化温度37℃,转化液起始pH为6.0,ρ〔十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)〕=0.3 g/L使酶活提高了414%。c(Co2+)=10-3mol/L使酶活增高约50%,c(Cu2+)=10-2mol/L或c(Zn2+)=10-2mol/L使酶活下降约50%。Ca2+、Mg2+和Mn2+对酶活影响较小。     

超声在β-环糊精处理苯酚废水中的应用研究

研究了在超声辅助条件下β-环糊精(β-CD)处理含酚(苯酚)废水的吸附规律和处理苯酚废水的最佳工艺条件:超声频率20 k Hz,超声声强0.2 W/cm2,苯酚初始浓度100 mg/L,p H为6.0,溶液体积100 m L,反应温度40℃,吸附时间240 min,β-CD用量40 g/L,去除率最高达到1.28 mg/g,比单独使用环糊精提高0.26 mg/g。     

赖氨酸脱羧酶发酵工艺及酶学性质

考察了蜂房哈夫尼菌(H.alveiAS1.1009)的L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用,分析了培养基、温度、pH、激活剂等因素对酶活力的影响。实验结果表明,最适培养基成分为:ρ(蔗糖)=20 g/L、ρ(玉米浆)=20g/L、ρ(酵母膏)=5 g/L、ρ(牛肉膏)=3 g/L、ρ(蛋白胨)=10 g/L、ρ(氯化钠)=5 g/L、ρ(硫酸铵)=2 g/L、ρ(维生素B6)=5 g/L和ρ(L-赖氨酸)=5 g/L,100 mL发酵液中接种量为5 mL液体菌种。最佳转化工艺条件为:转化体系温度35℃、pH=5.0,ρ(菌体)=10 g/L,ρ(吐温-80)=0.15 g/L。L-赖氨酸脱羧酶在最适发酵和转化条件下比酶活可达7 984.43 U,底物转化率可达70%。     

过量表达甲酸脱氢酶提高大肠杆菌合成L-2-氨基丁酸的效率

为了实现L-2-氨基丁酸（L-ABA）的高效生物合成，借助pACYCDuet-1和pET28a共表达系统，构建了携带L-苏氨酸脱氨酶（L-TD）、L-亮氨酸脱氢酶（L-L-DH）和不同活性甲酸脱氢酶（FDH）编码基因的重组大肠杆菌，分别命名为：E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-Ec TD-Es LeuDH:pET28a-Cb FDH和E. coli BL21 (DE3)/p ACYCDuet-1-Ec TD-Es Leu DH:p ET28a-Cb FDHM。经诱导表达后，L-苏氨酸脱氨酶和L-亮氨酸脱氢酶在两个重组大肠杆菌中的表达水平基本一致，而后者的甲酸脱氢酶酶活表达水平为(342.00±9.40) IU/mL，显著高于前者的(196.00±6.20) IU/mL。在50 mL反应体系中，200 mmol/L L-苏氨酸经220 r/min、30℃下反应6 h时，前者L-ABA得率为71%，后者为85%。结果表明，提高甲酸脱氢酶的表达水平可以显著提高L-ABA的合成效率。此外，优化反应温度后，在35℃下反应6 h时，L-ABA的得率可达90%。     

重组酪氨酸酚裂解酶全细胞催化合成L-酪氨酸

利用基因工程手段重组表达了弗氏柠檬酸杆菌来源的酪氨酸酚裂解酶(TPL),以丙酮酸和L-丝氨酸为底物全细胞催化合成L-酪氨酸,考察了pH、温度、表面活性剂、金属离子、铵盐种类和氯化铵浓度等因素对L-酪氨酸合成的影响,并比较了两种底物合成L-酪氨酸的转化率。结果表明,TPL的最适反应条件是45℃,pH=8.0,4mmol/L PLP,氯化铵浓度350 mmol/L。1 mmol/L triton-x 100对TPL酶活有促进作用,金属离子对TPL酶活都有明显的抑制作用。0.1 mol/L丙酮酸的转化率约是L-丝氨酸的1.8倍。     

酶法制备D-谷氨酸和γ-氨基丁酸的工艺研究

考察了大肠杆菌AS1．505的L-谷氨酸脱羧酶对L-谷氨酸的专一脱羧作用,分析了转化体系温度、pH值等因素对L-谷氨酸脱羧酶活力的影响。实验结果表明最佳工艺为：温度37℃,转化体系pH值4．8,茵体浓度6g／L,吐温-800．15g／l,菌龄14h,底物浓度50g／L。L-谷氨酸脱羧酶在最适转化条件下比酶活可以达到15036U。1g湿菌体可重复使用3次共转化DL-谷氨酸25g,其中L-谷氨酸可以完全转化为γ-氨基丁酸。D-谷氨酸及γ-氨基丁酸的总收率可以分别达到理论收率的87％和85％。     

碳源对假单胞菌NX-1产生L-天冬氨酸β-脱羧酶的影响

比较了假单胞菌 NX- 1在各种糖类物质、有机酸和氨基酸培养基上生长和合成 L -天冬氨酸β-脱羧酶(ADL )的情况 ,结果表明用不同的碳源培养基 ,NX- 1的生长和产酶表现出明显的差异。 NX- 1能利用糖类物质生长 ,但 ADL合成受阻遏。三羧酸循环中间体是 ADL合成的良好的碳源 ,谷氨酸是 ADL酶合成最好的诱导剂 ,其诱导合成的 ADL是富马酸为碳源时的 2倍。对 L -谷氨酸 (L - Glu)刺激 ADL酶生成的机理进行初步分析 ,认为 L - Glu通过自身 (而不是由 L - Glu衍生出的任何代谢物 )和 ADL合成的有关基因作用强烈诱导 ADL合成