及鉴定

目的研制基因工程胰高血糖素,用于治疗因注射胰岛素或口服抗糖尿病药物而引起的严重低血糖反应.方法依据人胰高血糖素氨基酸组成序列,采用大肠杆菌出现频率高的氨基酸密码子,体外合成胰高血糖素基因序列,克隆于pGEX-1N质粒,转化入BL21(DE3)菌中,对阳性克隆转化质粒进行DNA测序.用IPTG诱导转化的胰高血糖素工程菌,产生谷胱苷肽转移酶的融合蛋白,经谷胱苷肽Sepharose4B亲和层析后,由FactorXa酶进行柱上切割,最后用RP-HPLC得到纯化产物.产品用质谱法测相对分子质量,并对N末端15个氨基酸测序.结果DNA测序显示克隆基因序列正确,产品相对分子质量为3486,N末端15个氨基酸序列与理论值相同,产率为1.9mg/L.结论获得以可溶性融合蛋白方式表达的胰高血糖素基因工程菌,适于快速生产天然序列重组胰高血糖素.     

应用pCYB1载体表达胰高血糖素

目的 研制基因工程胰高血糖素。方法 利用pCYB1表达载体,亚克隆胰高血糖素基因后转化于BL21（DE3）菌种,并对阳性克隆的质粒进行DNA测序。检测不同条件下,IPTG诱导胰高血糖素-intein-几丁质结合结构域（CBD）组成的融合蛋白表达量,确定工程菌表达最适条件。利用几丁质结合柱进行亲和层析,在DTT作用下由intein在柱上进行自我切割,纯化胰高血糖素。SDS-PAGE检测融合蛋白表达量,SDS-PAGE在Tris-Tricine缓冲系统中电泳检测纯度,Lowry法检测蛋白质含量,Western blot检测免疫原性,升血糖实验检测活性并进行 N-末端测序。结果DNA测序显示表达产物基因序列正确,纯化胰高血糖素具有免疫原性和生物学活性,N-端15个氨基酸与天然产品相同,电泳呈单一谱带,产率为1.25mg/L。结论 获得分泌胰高血糖素基因工程菌,适于快速大规模生产。     

类胰岛素生长因子I(IGF-I)基因的克隆及融合蛋白的表达

目的 扩增类胰岛素生长因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）２１０ｂｐ的ＤＮＡ片段,将其克隆到ＰＧＥＸ－１ λＴ质粒,并转化到 Ｅ．ｃｏｌｉ　ＮＨ５２２中高效表达。方法 用改进的ＲＴ－ＰＣＲ法合成人肝脏ｃＤＮＡ,然后从该ｃＤＮＡ文库中扩增出ＩＧＦ－Ｉ基 因。将扩增的ＩＧＦ－Ｉ ｃＤＮＡ用 ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲ　Ｉ双酶切后,插入到同样双酶切处理的ｐＧＥＸ－１λＴ载体中,连接转化 Ｅ． ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２,筛选克隆,酶切鉴定后,进行了核苷酸序列分析及表达。结果 将ＩＰＴＧ诱导表达的菌体离心收集,经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,在相对分子质量３４０００处可见明显高表达带,表达量可占菌体蛋白总量的２０％以上。免疫印迹表 明重组蛋白具有ＩＧＦ－Ｉ的抗原性。结论　重组人ＩＧＦ－Ｉ的成功克隆与表达,将为进一步研究人ＩＣＦ－Ｉ的生物学特性 打下基础。     

中国流行株HIV-1Gag与IFN-α2b重组质粒的构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 ＨＩＶ－ １Ｇａｇ与 ＩＦＮ－ α２ｂ共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以 核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ－ＩＦＮ,通过间接免疫荧光 试验、ＤｏｔＥＬＩＳＡ检测Ｃａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,进行淋巴细 胞转化试验、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测。 结果构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,诱导特异性 ＣＴＬ反应,当和 ＩＦＮ－α２ｂ共表达时免疫效果更加显著。结论与 Ｇａｇ蛋白共表达的 ＩＦＮ－ａ２ｂ能够进一步提高细胞 免疫与体液免疫水平,构建的重组质粒为ＨＩＶ－１ＤＮＡ疫苗的研究奠定了一定实验基础。     

人血管生成素基因的克隆与表达

目的 为了获得人的血管生成素基因,并在原核表达系统中进行表达。方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ技术 从人的肝脏组织中扩增出Ａｎｇ基因片段,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中进行序列分析,再亚克隆到原核表达到 ｐＥＴ２８ａ（＋）载体中。结果　构建了重组表达载体ｐＥＴＡ,转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后,经ＩＰＩＧ诱导,Ａｎｇ基因蛋白在 ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达了相对分子质量约为１７０００的重组蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明,外源蛋白的表达量 占菌体蛋白总量的１０．６４％。结论 Ａｎｇ基因的克隆与表达为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础。     

OCCIDENTAL 和 GEON合资建厂

据海外报道 ,ＯＣＣＩＤＥＮＴＡＬ石油公司和ＧＥＯＮ公司日前共同组建合资公司ＯＸＹＶＩＮＹＬＳ(其中ＯＣＣＩＤＥＮ ＴＡＬ公司占 76 %的股份 ,ＧＥＯＮ公司占 2 4%的股份 ) ,该公司将成为世界第 3、北美第 1的聚氯乙烯生产企业。ＯＸＹＶＩＮＹＬＳ公司的聚氯乙烯产能将为 190 .5万ｔ/ａ ,ＯＣＣＩＤＥＮＴＡＬ公司和ＧＥＯＮ公司称 ,新的合资公司将使他们能够节省 80 0 0万美元 /ａ的营业成本OCCIDENTAL和GEON合资建厂     

乙型肝炎病毒S基因变异株的研究

目的　对７份ＨＢｓＡｇ诊断试剂检测结果不一致的样品进行确证并分析其原因。方法采用套式 ＰＣＲ法对７份样品进行ＤＮＡ扩增,并将阳性产物克隆到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体上,然后进行测序并对其序列进行分析。 结果　７份样品中６份为ＨＢＶ　ＤＮＡ阳性,其中５份与Ａｂｏｏｔｔ和Ｏｒｔｈｒｏ　ＨＢｓＡｇ试剂无反应或反应较弱,而且其ａ决定 簇的氨基酸均在１３４位发生改变,由Ｆ变为 Ａ;１份与 Ａｂｂｏｔｔ和Ｏｒｔｈｒｏ ＨＢｓＡｇ试剂反应较强,其ａ决定簇的氨基酸也 在１３４位发生改变,但由Ｆ变为Ｓ。结论　国内外首次报道ＨＢｓＡｇ ａ决定簇１３４位由 Ｆ变为 Ａ后,其抗原性明显降 低,不易被ＨＢｓＡｇ试剂检出;而１３４位由对变为 Ｓ后,其抗原性无明显改变。     

应用蛋白质工程法制备含硒单链抗体酶

目的 制备一种具有谷胱甘肽过氧化物酬（ＧＰＸ）活性的含硒单链抗体酶。方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ方 法从杂交瘤细胞株２Ｆ３中扩增出单克隆抗体重链可变区和轻链可变区基因。经ＤＮＡ序列测定后,构建成表达载体 ｐＴＭＦ－ｓｃＦｖ,经过金属螯合层析纯化、复性和化学诱变,得到含硒单链抗体酶。结果 将重组质粒ｐＴＭＦ－ｓｃＦｖ分别转 化入大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）和 ＢＬ２１（ｃｏｄｅｎ　ｐｌｕｓ）,表达目的蛋白分别占菌体总蛋白的５％－１０％、１５％－ ２０％和 ２５％－３０％。该重组蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量为３００００。其 ＧＰＸ活性为３４００Ｕ／μｍｏｌ,接近天 然酌水平。结论 为工业化制备含硒单链抗体酶奠定基础。     

国际水会议(IWC)论文摘要

全有机化学处理 ,特别是高磷酸盐和高钙容忍度处理方案的开发———ＳＥＲＧＩＯＣＡＳＴＲＯ ,ＩＮＳＴＲＯ ,ＩＮＳＴＩＴＵＴＯＭＥＸＩ ＣＡＮＯＤＥＬＰＥＴＲＯＬＥＯ(ＩＷＰ) ,ＭＥＸＩＣＯ ,Ｄ .Ｆ .,ＭＥＸＩＣＯ .ＩＷＣ— 1999— 49　　作者评述了一种高磷酸盐含量的“全有机”配方的开发。该配方可在比较温和的 ｐＨ下运行 ,运行安全可靠 ,腐蚀率在 0 .0 2 5ｍｍ/ａ以下 ,配方组成是环境友好的。Ｃｏｎｅｍａｕｇｈ电厂凝结水精处理器的升级———ＧＥＲＡＬＤＧＡＬＬ ,ＧＰＵ/ＧＥＮＣＯ ,ＮＥＷＦＬＯＲＥＮＣＥ ,ＰＡ .ＩＷ…     

重组人生长激素的原核分泌表达及其活性分析

目的构建重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)分泌表达质粒,进行原核表达,并分析其活性。方法人工合成包含phoA启动子、STⅡ信号肽序列及hGH基因优化序列的目的基因,与pBR322载体连接,构建重组克隆质粒pBR322-hGH;再将目的基因亚克隆至pACYC184载体,构建重组表达质粒pAC-hGH,进行酶切鉴定及测序分析。将鉴定正确的重组表达质粒pAC-hGH转化至感受态大肠埃希菌W3110中,构建重组工程菌,经诱导表达后进行DEAE-Sepharose FF纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻色谱、N-末端氨基酸序列及活性分析。结果重组表达质粒经酶切及测序鉴定,构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析可见相对分子质量约22 000的目的条带,菌体相对表达量达30%以上;纯化产物电泳纯度达95%以上,分子排阻色谱保留时间及N-末端15个氨基酸均与国家标准品一致,比活性大于3.0 IU/mg。结论成功构建了分泌表达rhGH的重组质粒,且获得了纯度及活性均较高的rhGH,为其产品的开发奠定了基础。     

Rhizomucor miehei triglyceride lipase is processed and secreted from transformedAspergillus oryzae

The cDNA encoding the precursor of theRhizomucor miehei triglyceride lipase was inserted in anAspergillus oryzae expression vector. In this vector the expression of the lipase cDNA is under control of theAspergillus oryzae α-amylase gene promoter and theAspergillus niger glucoamylase gene terminator. The recombinant plasmid was introduced intoAspergillus oryzae, and transformed colonies were selected and screened for lipase expression. Lipase-positive transformants were grown in a small fermentor, and recombinant triglyceride lipase was purified from the culture broth. The purified enzymatically active recombinant lipase (rRML) secreted fromA. oryzae was shown to have the same characteristics with respect to mobility on reducing SDS-gels and amino acid composition as the native enzyme. N-terminal amino acid sequencing indicated that approximately 70% of the secreted rRML had the same N-terminal sequence as the nativeRhizomucor miehei enzyme, whereas 30% of the secreted rRML was one amino acid residue shorter in the N-terminal. The recombinant lipase precursor, which has a 70 amino acid propeptide, is thus processed in and secreted fromAspergillus oryzae. We have hereby demonstrated the utility of this organism as a host for the production of recombinant triglyceride lipases.     

丝状支原体丝状亚种SC型LppB基因的克隆与表达纯化

目的克隆丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)LppB蛋白基因,并进行表达及纯化。方法通过PCR,扩增MmmSC标准株PG1的LppB全基因,克隆至pMD18-T载体上,并测序鉴定。同时选LppB基因中两个TGA之间903bp片段,与pET30a载体构建重组质粒,进行诱导表达,表达产物经Ni-NTA-His系统纯化。结果PCR扩增的LppB基因长度片段约1869bp,与预期大小相符。将其与NCBI上发布的Afade株、LC型代表株Y-goat和同属的Bovine7株的LppB基因序列相比较,同源性分别为99·8%、92·8%和76·7%,氨基酸同源性分别为99·2%、90·2%和67·0%。经Ni-NTA-His系统纯化,得到纯净的单一蛋白。结论已成功克隆了PG1的LppB蛋白基因,并进行了表达及纯化。     

大肠杆菌肉碱脱水酶基因的克隆、测序及高效表达

［摘 要］目的 克隆并表达大肠杆菌肉碱脱水酶基因。方法 用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌K12s中扩增大肠杆菌肉碱脱水酶基因caiB，测定其DNA序列，将caiB基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET－28a（＋）中，构建表达质粒pETCaiB，转化大肠杆菌BL21（DE3），用1mmol/L异两基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果 克隆得到的肉碱脱水酶编码基因 caiB长度为 1221bp，与文献报道值相比,DNA序列有26个不同，氨基酸序列只有一个不同，即302位的丙氨酸变为苏氨酸。重组菌经IPTG诱导，可高效表达，SDS－PAGE分析表达蛋白相对分子质量约43000，表达产物含量占菌体总蛋白45％以上。结论 得到了高效表达肉碱脱水酶的重组菌，为制备L-肉碱创造了条件。     

重组人Tau蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 重组人Tau蛋白的诱导表达和纯化。方法 将携带 Tau蛋白基因的工程菌株经IPTG诱导表达后,通过超声破碎、硫酸按盐析、离子交换层析、电洗脱等方法纯化Tau蛋白,以SDS-PAGE、非变性PAGE、Westem blot和N末端氨基酸测定等方法进行鉴定。结果 纯化Tau蛋白的得率为28.5％,在SDS-PAGE和非变性PAGE上呈均一的蛋白条带,其相对分子质量约为59000,N末端5个氨基酸测定结果为NH2-Met-Ala-Glu-Pro-Arg-。结论 本实验采用纯化重组人Tau蛋白方法是可行的。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。     

刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体在大肠杆菌中表达及在tPA纯化中的应用

目的构建刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体(rserETI)原核表达载体,制备表达产物,用于tPA的纯化。方法设计合成rserETI编码序列DNA片段,以PCR法扩增出全长编码区序列,经酶切后克隆至pET9a表达载体,转化大肠杆菌JM109DE3,以IPTG诱导表达。表达产物经变性、复性、QFF层析纯化后,测定其活性,并与溴化氰活化的Sepharose偶联合成亲和层析柱,纯化rtPA。结果rserETI的表达量约占大肠杆菌菌体总蛋白的30%,复性率为80%,经QFF层析纯化后,蛋白浓度为1.58mg/ml,SDS-PAGE检测显示无杂蛋白污染,纯度大于95%,对rtPA突变体的抑制比活性为4×104IU/mg。偶联合成的rserETI-Sepharose亲和层析柱能特异性地纯化rtPA,rtPA突变体纯度达96%,比活性为5.07×105IU/mg。结论已成功构建了rserETI原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达,制备的表达产物可用于rtPA的纯化。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal entertoxin B,SEB)。方法以合成的SEB全基因序列为模板,PCR扩增SEB基因片段,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-SEB,转化E.coil BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经硫酸铵盐析、SP阳离子层析柱、Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱纯化后,用Thrombin切除组氨酸标签,再经Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱和DEAE阴离子层析柱纯化。结果重组原核表达质粒pET-28a-SEB经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为31 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%。最终纯化后的重组SEB蛋白纯度可达90%以上。结论成功构建了SEB基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了重组SEB蛋白,为进一步研究其致病机理及防控方法奠定了基础。     

Expression and characterization of a cytotoxic human-frog chimeric ribonuclease: potential for cancer therapy

Onconase is a cytotoxic ribonuclease with antitumor properties. A semisynthetic gene encoding the entire protein sequence was constructed by fusing oligonucleotides coding for the first 15 and last six of the 104 amino acid residues to a genomic clone that encoded the remaining amino acid residues. Additionally, the 15 N-terminal amino acid residues of onconase were replaced with the first 21 amino acid residues of the homologous human RNase, eosinophil-derived neurotoxin, EDN. Two versions of the hybrid EDN-onconase protein were cloned, expressed and purified. The chimera that contained a glycine in lieu of the aspartic acid present in native onconase (position 26 in the chimera) exhibited enzymatic activity more characteristic of EDN than native onconase and was considerably more active with respect to both RNase activity and cellular cytotoxicity than recombinant onconase. In contrast to native or recombinant onconase, the EDN chimera was recognized by anti-EDN polyclonal antibodies, demonstrating that the chimera also shared structural antigenic determinants to the human enzyme. These results demonstrate that a chimeric ribonuclease has cytotoxicity comparable to onconase in two out of four cell lines tested. The implications with regard to cancer therapy are presented.      

X盒结合蛋白1-u的原核表达及纯化

目的构建X盒结合蛋白1-u(XBP1-u)基因原核表达质粒,表达并纯化XBP1-u蛋白。方法利用RT-PCR技术从肝癌细胞HepG2中扩增XBP1-u基因,先插入中间载体pGEM-Teasy,再将其克隆至原核表达载体pET32a,构建重组原核表达质粒pET32a-XBP1-u,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果测序分析证实,克隆入pET32a的XBP1-u序列与GenBank中登录的XBP1-ucDNA序列一致。IPTG的最佳诱导浓度为0.5mmol/L,最佳诱导时间为6h。目的蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为33000。纯化的蛋白经SDS-PAGE分析显示单一条带,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了XBP1-u基因原核表达质粒,表达并纯化了XBP1-u蛋白,为XBP1-u在肿瘤发病中的作用机制及在应激性疾病临床治疗中的研究奠定了基础。