生物被膜肺炎克雷伯杆菌AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶的检测

目的: 探讨生物被膜(BF)菌的耐药机制,为临床合理应用抗生素提供理论依据。方法: 应用改进的平板培养法建立肺炎克雷伯杆菌BF模型,用银染法和扫描电镜观察鉴定。采用改良三维试验法检测超广谱β-内酰胺酶(ESBIs)及AmpC酶。结果: 浮游肺炎克雷伯杆菌单产AmpC酶,单产ESBLs酶及同时产ESBLs和AmpC酶的菌株分别为2.5%(1/40)、20.0%(8/40)、2.5%(1/40);BF肺炎克雷伯杆菌单产AmpC酶,单产ESBLs及同时产ESBIs和AmpC酶的菌株分别为20.0%(8/40)、45.0%(18/40)、22.5%(9/40)。对浮游组和BF组的检出率两两分别进行x²检验,BF组各酶的检出率均明显高于普通浮游组各酶的检出率(P<0.05)。产酶BF肺炎克雷伯杆菌对8种抗生素(除亚胺培南全部敏感外)的耐药率均较高。结论: BF的形成和产生ESBL及AmpC酶的协同作用是肺炎克雷伯杆菌耐药的主要原因之一。     

2012年我院临床分离病原菌及耐药性监测分析

目的: 了解医院感染病人病原菌的分布及其耐药情况,指导临床合理使用抗菌药物。方法: 收集2012年1~6月份医院分离出的所有病原菌,采用VITEK-2对其进行鉴定及药物敏感试验,WHONET5.5软件进行数据分析。结果: 共分离出病原菌2791株,以大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌最多见,分别占 18.99%、15.84%、11.03%、8.53%、7.45%;肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的耐药率较高,其中鲍曼不动杆菌的耐药最严重。结论: 医院感染病原菌的分离率和耐药性逐年增加,为控制多重耐药菌的蔓延,必须加强抗菌药物的合理使用。     

Poly NP试验及MPNP试验快速检测肺炎克雷伯菌多粘菌素类耐药表型的应用评估

目的:探讨快速多粘菌素NP试验（rapid polymyxin NP test,Poly NP test）对多粘菌素类耐药肺炎克雷伯菌的检测价值;进一步评估改良快速多粘菌素NP试验（modified rapid polymyxin Nordmann/Poirel test,MPNP）对产MCR肺炎克雷伯菌的检出价值。方法:本研究共纳入48株菌,包括14株多粘菌素类敏感肺炎克雷伯菌（polymyxin sensitive Klebsiella pneumoniae,PolS-KP）,29株多粘菌素类耐药细菌（26株为多粘菌素类耐药肺炎克雷伯菌(polymyxin resistant Klebsiella pneumoniae,PolR-KP),3株为多粘菌素类天然耐药菌）,以及5株非发酵菌。以微量肉汤稀释法的结果为标准,采用Poly NP试验检测多粘菌素类的药敏表型。PCR及测序确定肺炎克雷伯菌的多粘菌素类染色体介导的耐药基因pmrA/pmrB,phoP/phoQ,mgrB和质粒介导的耐药基因mcr-1～mcr-8,采用MPNP试验检测是否为产MCR阳性菌株。结果:29株多粘菌素类耐药菌,3株天然耐药细菌的Poly NP试验均为阳性;26株PolR-KP中,24株为Poly NP试验阳性,2株为阴性;14株PolS-KP均为阴性,且所有结果均在2 h内出现最终颜色变化。该方法判断肺炎克雷伯菌多粘菌素类耐药表型的敏感性和特异性为93.1%和100%。26株PolR-KP中,有4株为MCR阳性,其中3株产mcr-1,1株产mcr-8;22株为染色体介导的耐药,其中12株为双组分系统PmrAB突变,4株为双组分系统PhoPQ突变,6株为mgrB基因改变。4株MCR阳性菌株的MPNP试验表现为阴性结果,其余非MCR株的PolR-KP和PolS-KP,以及多粘菌素类天然耐药菌株的MPNP均表现为阴性结果。MPNP试验不能筛选出MCR阳性的肺炎克雷伯菌。结论:Poly NP试验快速,特异性强,敏感性高,可用于临床多粘菌素类耐药肺炎克雷伯菌的快速检测。MPNP试验对MCR阳性肺炎克雷伯菌检出不佳,仍需进一步探讨适用于肺炎克雷伯菌的MCR快速表型检测方法。     

鲍曼不动杆菌的耐药性及产ESBL和碳青霉烯酶分析

目的: 分析我院鲍曼不动杆菌的耐药性及产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和产碳青霉烯酶情况。方法: K-B法进行药物敏感试验, 运用表型确证试验检测ESBL, 改良Hodge试验检测碳青霉烯酶。结果: 135株鲍曼不动杆菌中,对亚胺培南和美罗培南的耐药率高达 72.6%,对阿米卡星、头孢噻肟等10种抗菌药物耐药率为 61.5%~100.0%,对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率最低为 34.8%,其次是左氧氟沙星耐药率为 54.1%。其中有22株检出ESBL占 16.3%;46株检出碳青霉烯酶占 34.1%。结论: 我院鲍曼不动杆菌耐药率高,应加强细菌检测和药敏试验,指导临床合理应用抗菌药物。对于临床经验用药建议选用头孢哌酮/舒巴坦;鲍曼不动杆菌对β-内酰胺类药物耐药可能与产ESBL和碳青霉烯酶有关。     

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制及呼吸机相关性感染的流行病学分析

目的: 探讨碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia, CRKP）耐药机制及临床分离株与呼吸机分离株之间的遗传相关性。方法: 收集41株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌,其中28株为临床分离株,13株为呼吸机分离株。改良Hodge试验检测碳青霉烯酶,亚胺培南/EDTA结合（DDTs）及协同（DDST）试验检测金属酶,双纸片增效试验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）,纸片扩散法检测药敏试验,E-test检测肺炎克雷伯菌对替加环素的MIC。PCR检测耐药基因,产物测序,确定其基因型。采用多位点序列分型（MLST）对CRKP进行分子遗传学分析。 结果: 所有菌株改良Hodge试验均阳性,基因检测均为blaKPC-2;只检测到一株菌产金属酶,基因型为blaNDM-1;未检测出blaGES、blaVIM、blaSPM、blaIMP及blaOXA等其它碳青霉烯酶基因。ESBLs检出率为 43.90%,但所有菌株均携带β-内酰胺酶基因,以blaCTX-M-24为主（92.68%, 38/41）,其次为blaSHV-12（78.05%, 32/41）。38株携带blaTEM中,其中35株为广谱blaTEM-1,只有3株为超广谱blaTEM-104。所有菌株均检测出外膜蛋白ompk35基因,95.12%的菌株有外膜蛋白ompk36基因。28株临床分离株大部分来自ICU病房（67.86%, 19/28）,其中有24例感染患者使用了呼吸机;41株CRKP对临床常用的18种抗菌药物中100%耐药的有9种,耐药率最低的为四环素类,分别为替加环素（2.44%, 1/41）,米诺环素（7.32%, 3/41）和四环素（14.63%,6/41）。MLST结果显示,所有呼吸机分离株均属ST11型,28株临床分离株有25株也属ST11型,2个新的ST型已被Pasteur MLST数据库确认收录并分别命名为ST1854和ST1855。结论: CRKP多重耐药情况非常严重,携带blaKPC-2基因是其碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因,存在ST11型肺炎克雷伯菌播散,且与呼吸机传播有关。     

siHybrids分子对耐药肺炎克雷伯菌kpc-2抑制作用研究

目的: 本研究采用RNA干扰技术和合成小分子抑制剂的方法,研究siHybrids分子对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯杆菌耐药性的影响。方法: 通过对临床分离的48株肺炎克雷伯杆菌进行药敏实验,初步筛选并收集了耐碳青霉烯类抗生素的菌株;进一步利用PCR检测,筛选出携带碳青霉烯酶基因kpc-2的耐药株。利用siHybrids技术,针对kpc-2设计合成siHybrids 杂合分子,对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因kpc-2进行特异性沉默后,通过荧光定量PCR实验检测siHybrids沉默靶基因kpc-2的体外表达水平,并通过联合抑菌实验验证siHybrids分子提高抗生素抗菌活性乃至逆转细菌耐药性的效果。结果: 合成的小分子siHybrids可以使耐药肺炎克雷伯杆菌kpc-2基因的表达下调,并且与碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南、厄他培南分别联合使用,可使肺炎克雷伯杆菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南由耐药转为敏感。结论: siHybrids可以特异地抑制耐药肺炎克雷伯杆菌kpc-2基因的表达,通过干扰产碳青霉烯酶基因kpc-2造成肺炎克雷伯杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药性的逆转。     

头孢哌酮/舒巴坦体外抗菌活性的研究

目的 研究头咆哌酮单用,及与舒巴坦联用在体外的抗菌活性。方法 采用琼脂平板稀释法测定头孢哌酮/舒巴坦(SPZ,比例1:1)、头孢哌酮(CPZ)和舒巴坦(SBT)对8种322株临床常见致病菌的最低抑菌浓度(MIC),并统计MIC₅₀、MIC₉₀ 、IC₅₀等数值。结果 除金黄色葡萄球菌外,SPZ对其它7种致病菌的抗菌活性均强于CPZ,MIC₉₀值均下降2~4倍;SPZ对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的MIC₅₀值较CPZ有极大的降低;SPZ对53.2%的肠菌科细菌和40.7%的绿脓假单胞菌的MIC值有2倍以上的降低,9.04%的肠杆菌科细菌和33.3%的绿脓假单胞菌对CPZ耐药,52.9 %和50.0 %的CPZ耐药菌对SPZ敏感。SBT虽对受试菌均无明显抗菌活性,但其可能通过对β-内酰胺酶的抑制作用,提高了CPZ的抗菌活性。结论 SPZ可适用于CPZ耐药菌引起的严重感染。     

老年支气管扩张合并急性感染的病原菌及其耐药性研究

目的: 了解老年支气管扩张患者急性感染的病原学分布及药敏情况, 指导临床抗菌药物的使用。方法: 对2000—2012 年本院呼吸科104份老年支气管扩张急性感染患者的痰标本进行细菌培养及药敏试验。结果: 150 例痰标本分离出致病菌107 株, 其中革兰氏阴性菌 87 株, 占81%, 排在前 3 位的致病菌分别是铜绿假单胞菌( 35%),肺炎克雷伯菌( 14% ),鲍曼不动杆菌(11%)。革兰氏阳性球菌8株(7%),真菌12株(11%)。药敏实验显示所分离出的革兰氏阴性杆菌对哌拉西林-他唑巴坦, 第 3、4 代头孢菌素及碳青霉烯类、多粘菌素等抗菌药物敏感性较高。结论: 老年支气管扩张急性感染的病原菌分布以革兰氏阴性杆菌为主, 铜绿假单胞菌排在首位,经验治疗时建议选用哌拉西林/他唑巴坦、头孢三代、四代或碳青霉烯类药物。     

Oct-4基因在胃癌顺铂耐药中的作用

目的: 建立胃癌BGC-823顺铂耐药细胞株,研究Oct-4基因在胃癌顺铂耐药中的作用。方法: 使用顺铂逐步增加剂量法诱导胃癌BGC-823细胞,以建立其多药耐药细胞株BGC-823/DDP;MTT细胞毒实验检测顺铂对肿瘤细胞的细胞毒作用;半定量RT-PCR检测Oct-4基因的表达;基因转染干扰Oct-4表达;Western blot实验检测Oct-4蛋白的表达改变。结果: 经过30~34周的诱导我们建立了胃癌BGC-823顺铂耐药细胞株;MTT细胞毒实验结果显示顺铂对BGC-823和BGC-823/DDP细胞的IC₅₀值分别为(2.33±0.12) 和(21.46±0.97) μmol/L(P<0.01),与BGC-823细胞比较,BGC-823/DDP细胞对顺铂耐药是其9.21倍;半定量RT-PCR检测显示胃癌耐药株BGC-823/DDP高表达Oct-4基因;Western blot结果显示化学合成的siRNA可以靶向下调Oct-4蛋白的表达;siRNA干扰BGC-823/DDP细胞Oct-4基因的表达后,BGC-823/DDP细胞对顺铂的的IC₅₀值从(22.04±1.84 ) μmol/L 减小到(6.15±0.53) μmol/L,二者差异具有统计学意义(P<0.01)。结论: 研究结果表明,Oct-4基因的高表达在胃癌顺铂的耐药中起着重要的作用。     

解脲支原体对7种抗生素的体外敏感性测定

目的: 了解非淋菌性尿道炎(NGU) 患者解脲支原体(UU) 对7 种抗生素的敏感性。方法: 采用微量肉汤稀释法测定体外药物敏感性, 对培养阳性的150 例患者进行了分析。结果: UU 对 7 种抗生素的敏感性的顺序由高到低依次为:交沙霉素(96 6.7 %) 、强力霉素(90.67 %) 、美满霉素(88.67 %) 、司巴沙星(58.67 %) 、 罗 红 霉 素 (39.33 %) 、 氧 氟 沙 星(18.00 %) 和阿奇霉素(8.00 %) 。UU 耐药率最高的为氧氟沙星(31.33 %), 其次为司巴沙星(18.67 %)和罗红霉素(18.00 %) 。结论: UU 存在多重耐药, 对UU 进行药敏监测对指导临床合理用药及防止耐药株的发生有重要意义。     

不同品系小鼠对mCPP诱导焦虑样行为的差异研究

目的: 评价BALB/c和ICR小鼠对1-(3-氯苯基)哌嗪单盐酸盐(mCPP)诱导焦虑样行为的差异。方法: 将两品系小鼠各分为四组:生理盐水对照组、mCPP焦虑组、地西泮对照组和地西泮+mCPP组。行为学检测前30 min腹腔注射地西泮、皮下注射mCPP,采用开场实验、明暗穿箱和高架十字迷宫比较两品系小鼠焦虑样行为的差异。结果: 地西泮使焦虑的BALB/c小鼠中央路程比值和中央时间比值增加,对ICR小鼠无作用;两品系小鼠运动总路程有差异。地西泮使焦虑小鼠进入暗箱潜伏期延长、明暗穿箱次数增加、暗箱滞留时间缩短,BALB/c小鼠对地西泮的反应比ICR小鼠更敏感。地西泮可使焦虑小鼠开臂进入次数百分比、开臂停留时间百分比和开臂探臂时间百分比增加,两品系小鼠仅在开臂停留时间和开臂探臂时间上有差异。结论: mCPP诱导焦虑小鼠比正常小鼠对地西泮的敏感性高;BALB/c小鼠焦虑水平较低,探究能力和风险评估能力较高,是抗焦虑药物研究中可供选择的较合适的动物品系。     

棕榈酸对C2C12细胞Toll样受体及其炎症因子表达的影响

目的: 探讨棕榈酸(PA)刺激对C2C12细胞Toll样受体(TLRs)及其炎症因子表达的影响,初步分析TLRs介导的免疫性炎症与胰岛素抵抗(IR)的关系。方法: 不同浓度PA与C2C12细胞体外共培养 16 h,测定细胞葡萄糖消耗量以确定IR细胞模型成型情况。荧光定量PCR法测定IR细胞TLR1~5 mRNA表达情况,ELISA法测定细胞培养液中炎症因子TNF-α、IFN-β的含量。结果: PA刺激能明显降低C2C12细胞的葡萄糖消耗量,表现为IR。PA并可诱导C2C12细胞TLR2、TLR4 mRNA 高表达,使TNF-α、IFN-β分泌增加,而对TLR1、TLR3、TLR5 mRNA表达无明显影响。结论: TLR2、TLR4信号转导通路及其启动的炎症反应可能参与了PA诱导IR形成的病理过程。     

新的四氢异喹啉类化合物CPUE1逆转K562 A02 细胞的多药耐药性

目的 研究新的四氢异喹啉类化合物CPUE1逆转K562/A02 细胞多药耐药性的作用及机制。 方法 在CPUE1 的作用下, 用MTT 法检测长春新碱(vincristine, VCR) 对K562/A02 多药耐药细胞的细胞毒作用的变化, 使用DNA 分析和Annexin-Ⅴ/PI 双染法研究CPUE1 对VCR 诱导K562/A02 细胞凋亡的影响, 流式细胞仪检测CPUE1 对P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp) 外排罗丹明123 (rhodamine123, Rh123)的作用。 结果 CPUE1 能明显提高VCR 对K562/A02多药耐药细胞的细胞毒作用以及凋亡诱导作用,10 μmol·L^-1的CPUE1 能使K562/A02 对VCR 的IC₅₀值由60.54 μmol·L^-1 降至4.17 μmol·L^-1。CPUE1还能抑制Rh123 外排从而增加细胞内Rh123 的蓄积浓度。 结论 CPUE1 通过抑制P-gp 的活性逆转K562/A02 细胞的多药耐药性。     

一种针对mdr1 基因的寡核苷酸-阿霉素偶联物:对KB-A-1 细胞的毒性及其抑制P-gp 蛋白表达的效果

目的:癌细胞膜上P-gp 糖蛋白的过量表达是肿瘤多药抗性的主要机制。人体内编码P-gp 糖蛋白的基因中仅有mdr1 涉及多药抗性。本研究中设计了针对mdr1 的反义核酸与阿霉素的偶联物, 并且对其细胞毒性进行了考察。同时对偶联物对人表皮癌细胞株KB-A-1 内的P-gp 蛋白的表达也做了分子水平上的研究。方法:使用MTT 法考察偶联物对KB-A-1 细胞的毒性。用HPLC 考察偶联物对细胞内阿霉素的积累量的影响。对于P-gp 蛋白表达的变化, 主要是通过RT-PCR 及WesternBlot 方法进行了研究。结果:偶联物的细胞毒性比寡核苷酸高。在低剂量的偶联物(0.5 μmol·L^-1) 的作用下, 细胞对阿霉素的敏感性提高。偶联物能有效的提高细胞内阿霉素的积累量。并且从RT-PCR 及WesternBlot看, 偶联物处理后的细胞内P-gp 表达最少。结论:选用合适的基团, 对反义核酸进行结构修饰能够较好的增强反义核酸的性能。采用阿霉素作为偶联基团尽管增强了细胞毒性, 但是在更大程度上增强了其抑制P-gp 蛋白的效力, 提高了肿瘤耐药性的逆转倍数, 具有一定的潜在应用价值。     

白藜芦醇及其糖苷白藜芦醇苷与药物外排转运体的相互作用研究

目的: 通过多种不同细胞模型研究两种芪类天然化合物白藜芦醇(trans-resvenatrol,TR)及白藜芦醇苷(transpiceid,TP)与多种药物外排转运体间的相互作用。方法: 高效液相及荧光分光光度法分别测定细胞内TR.TP及罗丹明123的浓度MTT比色法测定细胞活性,Westemblot法测定P-糖蛋白的表达。结果: P-糖蛋白抑制剂及底物(维拉帕米和罗丹明123)对TR及TP的细胞摄取无影响。多药耐药相关蛋白2抑制剂,丙磺舒可将TR及TP的细胞摄取量分别增加1.3倍和1.6倍。TR及TP能够显著性增加大鼠脑微血管细胞对罗丹朋123的摄取及阿霉素在人白血病阿霉素耐药细胞上的毒性,但对人白血病阿霉素耐药细胞上P-糖蛋白的表达没有显著性改变。米托蔥醌在人非小细胞肺癌细胞.上的毒性作用不受TR及TP的影响。结论: TR及TP可以抑制P-糖蛋白的外排作用,但其本身不被P-糖蛋白外排,而是被多药耐药相关蛋白2外排。TR及TP对人乳腺癌多药耐药蛋白的外排作用没有影响。     

中药单体白花丹醌对鲍曼不动杆菌的耐药逆转作用

目的: 探索中药单体白花丹醌对临床分离的鲍曼不动杆菌耐药性的逆转作用。方法: 取临床分离的鲍曼不动杆菌53株,检测其对临床常用的14种抗菌药物的敏感性。观察中药单体白花丹醌对标准菌株的直接作用。在确定白花丹醌以及羰基氰化氯苯腙(CCCP)的工作浓度以后,观察对比白花丹醌与阳性药CCCP的外排抑制试验结果。结果: 临床分离的53株鲍曼不动杆菌对临床常用的14种抗菌药物耐药率较高,其中氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢西丁耐药率最高,分别为100%、100%、98.1%、98.1%。其余药物耐药率也均在50%以上。白花丹醌对标准质控菌的直接抗菌作用较弱。而白花丹醌与CCCP均显示了对庆大霉素、诺氟沙星、米诺环素和氯霉素的增敏作用,其外排阳性率分别达 11.3%和 18.9%,3.8%和 7.5%,13.2%和 17.0%,28.3%和 20.8%,两组之间无统计学差异(P>0.05)。结论: 鲍曼不动杆菌临床耐药情况严重,而白花丹醌作为一种中药单体可能具有一定的耐药逆转作用。