栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染与疾病发生关系探讨

超薄切片和负染色技术检测栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染状况，结果表明：在栉孔扇贝大规模死亡的7、8月份，病毒检出率分别为80％、100％，此时，病毒感染强度也达到最高；而海湾扇贝整个养殖期间病毒感染率和感染强度均维持在较低的水平，未出现明显的涨落。二种扇贝均检测到类立克次氏体（RLO），但类立克次氏体的感染率和感染强度均未出现明显的涨落，似与扇贝死亡的关系不大。综合分析认为，病毒极可能是导致栉孔扇贝大规模死亡的直接病原。     

用RAPD技术对我国栉孔扇贝野生种群与养殖群体的遗传结构及其遗传分化的研究

利用RAPD技术对我国栉孔扇贝野生种群和养殖群体的遗传结构及其分化进行了研究，在对20个野生栉孔扇贝和20个养殖栉孔扇贝的基因组DNA的检测中，20个10碱基的随机引物共扩增出153条清晰可分辨的DNA片段，片段的长度为200－3000bp其中多态性片段分别为116和112条，野生种群和养殖群体的多态位点比例分别为75．82％，和73．47％，杂合度分别为0．27和0．26。根据基因频率计算出两个群体的近交系数为0．00129，遗传距离为0．028。栉孔扇贝野生种群的多态位点比例和杂合度处于较高水平，说明我国栉孔扇贝野生种群的遗传多样性水平较高，种质资源尚处于较好状态，应制定相应的渔业生产和管理措施加以保护，养殖群体的多态位点比例和杂合度都低于野生种群，这与人工累代养殖过程中，群体较小，近交机会增加有关。     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒感染的ELISA检测

应用纯化病毒免疫新西兰兔制备的抗血清，进行ELISA分析，检测栉孔扇贝体内急性病毒性坏死症病毒的感染情况。结果表明：一龄贝在整个养殖期间感染该病毒呈现低一高一低的涨落过程，其中7月下旬到8月中旬检出阳性率为75％～95％，为当年感染的高峰时期。对二龄贝感染该病毒的分析结果显示，二龄贝对病毒的感染可能具有一定的抗性。     

扇贝种间单对杂交一代幼虫ISSR标记的分离方式

通过对栉孔扇贝♀和华贵栉孔扇贝舍单对培育的♂个全同胞F1幼虫进行ISSR标记,分析了双亲位点在杂交子代中的传递分离方式。所得到的总位点数中双亲和杂交子代共有位点1#家系占35．4％,2#家系占27．1％,两单亲与杂交一代共享位点将近占30％左右,表明双亲所携带的遗传物质皆传递给了F1代,证实种间杂交的成功。但杂交种F1从栉孔扇贝获得的位点数稍多于华贵栉孔扇贝,且前者的位点在F1中出现频率明显高于后者。另外F1的每个个体与栉孔扇贝的遗传距离皆小于与华贵栉孔扇贝的距离,说明杂交子代在遗传上明显地偏向母本栉孔扇贝。另外在杂交子代中出现了较高比例的非孟德尔分离位点和非亲位点。     

栉孔扇贝种群的遗传变异分析

采用不连续聚烯酰胺凝胶电泳技术研究了中国栉孔扇贝和日本栉孔扇贝两个天然种群的六种同工酶。结果表明,两个种群具有基本相同的基因位点控制同工酶的表达,二者都具有居群内的个体差异,中国和日本的两个种群的多态位点比例（P．99）分别为41．18％和45．45％,平均杂合度观测值（Ho)分别为0．1295和0．1531,平均杂合度预期值（He)分别为0．1695和0．2331,各位点平均等位基因数（Ne)分别为1．5294和1．6363。日本栉孔扇贝自然种群的遗传变异明显高于中国栉孔扇贝自然种群。同时各群体中普遍存在杂合子缺失现象。     

栉孔扇贝EST中微卫星标记的筛选

使用RepeatMasker软件在栉孔扇贝的6935条ESTs中发现了42条微卫星序列。选取其中的7个序列，根据微卫星位点的旁侧序列设计引物，并对设计出的引物在中国、日本、韩国野生群体中进行多态性检测，发现有6对引物能产生扩增产物，其中有3对引物可望在以后的群体分析及连锁图谱的构建中加以应用。该结果初步证实了在栉孔扇贝的ESTs序列中存在微卫星位点，从而为扇贝生物中微卫星标记的筛选开辟了新的途径。     

温度刺激下栉孔扇贝不同组织热休克蛋白HSP70的表达研究

采用免疫印迹(Western blot)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)方法,研究了热激栉孔扇贝不同组织内热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的表达变化。免疫印迹结果显示,HSP70的诱导表达有组织特异性,即热休克可以使扇贝鳃组织中HSP70的表达明显升高,但在肌柱、外套膜和性腺组织中,未检测到HSP70的表达。流式细胞术结果表明：在不同的季节,相同的热刺激对扇贝血淋巴中HSP70的诱导表达存在差异。高温刺激后,栉孔扇贝血淋巴细胞中HSP70的表达量逐渐升高,在诱导7h时达到最高。     

栉孔扇贝热休克蛋白70基因Cdna的克隆与分析

应用表达序列标签法，获得了栉孔扇贝HSP70基因cDNA的部分序列，然后利用锚定PCR技术克隆到了该基因的全长cDNA。克隆到的HSP70 cDNA全长2553bp，编码区全长1902bp，可以编码634个氨基酸。Blast分析表明该序列与其他生物的HSP70基因具有很高的相似性。在该cDNA序列编码的氨基酸序列中含有3个HSP70家族的特征模体，结合Blast分析的结果，可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝HSP70的编码序列。该基因的克隆为进一步深入研究栉孔扇贝的抗逆机理以及指导扇贝的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。     

栉孔扇贝四倍体幼虫的诱导研究

以栉孔扇贝Chlamys farreri为材料，采用浓度为0．5mg／L的细胞松弛素B(CB)处理、抑制受精卵第一极体排放的方法，进行四倍体诱导研究。5次重复实验结果表明，诱导组和对照组的平均受精率分别为45．0％和56．6％，D形幼虫的平均孵化率分别为5．3％和51．1％。经胚胎和幼虫发育观察发现，在诱导组中异常原肠胚的比例高于对照组；受精后48h，诱导组的滞育担轮幼虫的比例显著高于对照组。在受精后48h采用流式细胞术检测孵化的D形幼虫，诱导组中四倍体幼虫的比例为36％-70％，平均为49％，同时发现了平均比例为31％的三倍体幼虫。本研究表明，该项技术能有效地诱发栉孔扇贝四倍体幼虫，但面临四倍体幼虫孵化率低的问题，今后应设法提高四倍体胚胎和幼虫的发育水平。     

免疫多糖对栉孔扇贝血淋巴中氧化酶活力的影响

于栉孔扇贝体中分别注射酵母聚糖和硒多糖两种免疫多糖后,分别测定了栉孔扇贝血清和血细胞中两种参与免疫防御的酚氧化酶（PO）和髓过氧物酶（MPO）的活力。结果表明,注射酵母聚糖后,血清中PO活力仅在1h时实验组极显著地高于对照组,而血细胞中无PO活力,注射硒多糖后,血清中PO活力在1和15h时时显著高于对照组,而血细胞中未检测到PO活力：血清中MPO活力在1、15和30h时,血细胞中MPO活力在1和15h时实验组显著高于对照组,说明酵母聚糖和硒多糖两种免疫多糖对栉孔扇贝血淋巴中PO和MPO的活力均有增强作用。     

急性病毒性坏死症病毒在栉孔扇贝不同器官的感染状况

应用超薄切片、负染电镜技术以及ELISA对自然发病和人工感染发病的栉孔扇贝之外套膜、鳃、肝胰腺、肾、肠、及闭壳肌等主要器官急性病毒性坏死症(Acute Virus Necrobiotic Disease，AVND)病毒的感染状况进行了研究。三种检测方法均表明，病贝的外套膜及肝胰腺为AVND病毒感染最严重的器官，肾以及肠组织次之，鳃及闭壳肌病毒感染程度最轻。本结果同时表明，AVND病毒在病贝体内广泛分布，侵染的细胞主要为上述器官皮下肌细胞的细胞质内，侵染细胞超微结构表现为生物膜肿胀，并出现“髓袢样”结构等病理变化。     

变温变压的优化组合对扇贝真空冷冻干燥过程影响的实验研究

为了获得调压调温的优化组合对栉孔扇贝真空冷冻干燥过程的品质、能耗和时间的综合影响,在前期研究的基础上,本文对两次变温和一次变压的温度和压力组合参数进行了五因素四水平的正交组合试验,并以能耗、冻干时间和复水率等三指标的综合加权平分值为指标,得出了各温度和压力条件影响冻干能耗及品质的主次关系为:加热板高温2>干燥室低压>加热板高温1>加热板低温>干燥室高压,各因素的最佳组合是加热板高温1为42℃,高温2为30℃,干燥室低压为25Pa,加热板低温为25℃,干燥室高压为80 Pa,在这个优化组合工艺条件下,扇贝的复水率达到83.7%,与16组实验中的最佳相比,复水率提高了12.20%,能耗下降了2.17%,干燥时间缩短了20%。     

栉孔扇贝脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆及其特征分析

作为模式识别蛋白的脂多糖葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein,LGBP)在无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要作用。本研究以鳗弧菌作为病原感染栉孔扇贝,构建全个体cDNA的质粒文库,用T3引物对文库进行随机测序得到一个667bp的cDNA片段(编号：c1305ct320cn336),它与普通蚯蚓的体腔裂解因子前体基因、海胆的β-1,3-葡聚糖酶、非洲疟蚊的革兰氏阴性细菌结合蛋白等有同源性。用T7引物对该克隆测序得到其3’末端。通过SMART-RACE技术克隆得到该克隆的全长cDNA序列。栉孔扇贝LGBP基因由1850个核苷酸组成,它有一个poly A尾巴,编码一条440个氨基酸的多肽。该多肽的分子量估计为47159．076Da,等电点为5．095。推导的氨基酸序列与蓝虾、斑节对虾、海胆、非洲疟蚊、淡水螫虾、普通蚯蚓及普通红蚯蚓等无脊椎动物模式识别蛋白具有高度的同源性。经用Garnier法预测,栉孔扇贝LGBL的二级结构包含螺旋构象10％,折叠片构象17％,转角构象21％,无规则卷曲53％,各种构象所占比例与普通红蚯蚓的体腔裂解因子前体相近。     

Efficient five-axis machining of free-form surfaces with constant scallop height tool paths

Generation of efficient tool paths is essential for the cost-effective machining of parts with complex free-form surfaces. A new method to generate constant scallop height tool paths for the efficient five-axis machining of free-form surfaces using flat-end mills is presented. The tool orientations along the tool paths are optimized to maximize material removal and avoid local gouging. The distances between adjacent tool paths are further optimized according to the specified scallop height constraint to maximize machining efficiency. The constant scallop height tool paths are generated successively across the design surface from the immediate previous tool path and its corresponding scallop curve. The scallop surface, an offset surface of the three-dimensional design surface based on the specified scallop height, is used to establish accurately the scallop curve with the constant scallop height. The present method was implemented and validated through the five-axis machining of a typical free-form surface. The results showed that the conventional isoparametric tool paths were over 36% longer in the total tool path length and less efficient than the constant scallop height tool paths generated by the present method.     

海湾扇贝g型溶菌酶基因cDNA的克隆与分析

通过EST和锚定PCR技术,从海湾扇贝(Argopecten irradians)中克隆得到一种溶菌酶基因的全长cDNA(全长659bp,编码200个氨基酸)。BLASTx分析的结果显示,它和脊椎动物g型溶菌酶相似性较高,却不同于无脊椎动物中已发现的c型和i型溶菌酶。在其编码的氨基酸序列中发现了g型溶菌酶的活性中心(Glu82,Asp97,Asp108),同时6个保守的半胱氨酸也与鸟类和鱼类的g型溶菌酶相一致。结合BLASTX分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是一种在无脊椎动物中首次发现的g型溶菌酶的编码序列。采用Clustalw软件,对多种脊椎动物c型、g型溶菌酶和无脊椎动物c型、i型溶菌酶以及本研究发现的无脊椎动物g型溶菌酶进行了分析,结果发现,无脊椎动物c型、i型溶菌酶和脊椎动物c型溶菌酶同源性较高,而海湾扇贝g型溶菌酶和脊椎动物g型溶菌酶同源性较高。由此说明c型、g型溶菌酶从无脊椎到脊椎动物的进化是平行发生的,这对进一步研究溶菌酶及其分子进化具有重要意义。     

SARS病毒特异性靶基因的多重PCR检测技术研究

本研究探讨了多重PCR技术在SARS病毒检测中的应用。根据香港中文大学在GenBank上公开发表的SARS病毒基因组cDNA序列,人工合成克隆特异性靶基因DNA片段,以此片段作为阳性样品,根据世界卫生组织推荐的进行单PCR与多重PCR检测分析。以单PCR法获得了121bp、182bp及302bp的靶基因片段3条;以二重PCR法获得了121bp+182bp、121bp+302bp与182b+302bp的靶基因片段组合;以二重PCR法获得了121bp+182bp+302bp的靶基因片段组合。结果表明:多重PCR技术可成功应用于SARS病毒的检测。     

全自动酶免分析系统校准技术研究

研究了一种用于评价全自动酶免分析系统测试性能的校准技术。该技术分别就加样模块的加样正确度和精密度,孵育模块的孵育温度,洗板模块的洗涤残留率和交叉污染,读板模块的吸光度示值稳定性、示值误差、重复性和通道差异进行测试和评价。选取3款不同品牌设备进行适用性验证,试验结果表明:所选系统最大加样偏差和变异系数分别为-7.4%和8.0%;孵育温度偏差在±0.5 ℃范围内;最大洗涤残留率和交叉污染分别为0.8%和0.1%;10 min内最大示值波动为0.003,在所测波长和吸光度下的最大示值误差为0.019,最大变异系数为0.2%,最大通道差异为0.005。     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。