甘油添加策略对罗伊氏乳杆菌代谢特性的影响

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是一种新型的益生菌,为深入了解该菌代谢葡萄糖和甘油特性,采用发酵初期、对数期、静止期不同甘油添加策略,对发酵罐中L.reuteri CG001利用葡萄糖/甘油共底物发酵过程中代谢产物变化情况进行了探讨.结果表明,无论在何时加入甘油均会引起细胞代谢途径的迁移.初始时加入甘油,葡萄糖主要走乳酸和乙酸途径,净生成的NADH主要用于甘油代谢途径,因此会生成较多的1,3-丙二醇;对数期加入甘油,细胞同样会缓慢从乙醇途径向乙酸途径迁移,并在初期积累一定的3-羟基丙醛,继续加入葡萄糖后3-羟基丙醛迅速转化成1,3-丙二醇,最终发酵液中几乎检测不到3-羟基丙醛;静止期加入甘油,细胞能够积累较多的3-羟基丙醛,较高浓度3-羟基丙醛会导致细胞自身的死亡,同时观察到细胞具有利用自身代谢产物乳酸逆向生成乙酸,从而调节代谢过程中NADH/NAD的能力.     

若干因素对发酵法生产1,3-丙二醇的调控作用

利用一株新筛选的克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae ZJU 5205)对发酵法生产1,3-丙二醇进行了研究,考察了 pH、溶氧及添加辅助底物葡萄糖对发酵过程的调控作用。实验结果表明,相比于未调控 pH 发酵,恒定 pH 值发酵得到的菌体浓度明显增高,甘油消耗加快,1,3-丙二醇的最终浓度以及甘油到丙二醇的转化率(Y_(P/S))明显提高,分别达16.39g/L和0.51mol/mol;厌氧发酵时的菌体浓度和甘油消耗速率均高于微氧发酵,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率低于微氧发酵;添加葡萄糖为辅助底物能够有效促进菌体生长,但1,3-丙二醇最终浓度和转化率却低于以甘油为单一底物时的发酵结果。     

重组肺炎克雷伯菌发酵联产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇

对表达了高效醛脱氢酶的重组肺炎克雷伯氏菌以甘油为底物生产3-羟基丙酸和1,3-丙二醇的过程进行优化,将发酵过程中补料阶段甘油浓度分别控制为0~10, 10~20, 20~30 g/L,并分3次间歇性补加甘油. 结果表明,发酵过程中补料阶段控制甘油浓度在20~30 g/L,发酵26 h得到47.20 g/L 3-羟基丙酸和43.90 g/L 1,3-丙二醇;而间歇性补加甘油产物得率最高,发酵26 h时3-羟基丙酸和1,3-丙二醇相对甘油的得率分别为0.35和0.38 mol/mol. 3-羟基丙酸和1,3-丙二醇联产可实现辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的再生平衡,从而提高碳回收率.     

3-羟丙醛对Klebsiella pneumoniae发酵产 1,3-丙二醇的影响及其调控

中间产物3-羟丙醛在发酵液中的积累对Klebsiella pneumoniae细胞生长及1,3-丙二醇的合成有显著的抑制作用,而调节发酵的起始甘油浓度及控制发酵pH值可调控发酵液中3-羟丙醛的积累.当起始甘油质量浓度分别为20、30、50、70g/L的批式发酵中,发酵液中3-羟丙醛的积累的高峰分别为4.31、6.87、11.48及13.49mmol/L,当起始甘油质量浓度大于50g/L时,3-羟丙醛在到达积累高峰后不能被菌体有效转化,在发酵后期维持较高浓度,抑制了细胞生长及1,3-丙二醇的合成,发酵不能继续进行.控制发酵pH值为7.75～8.0可促进发酵液堆积的3-羟丙醛被迅速转化.在流加发酵中起始甘油质量浓度采用30g/L,发酵pH值控制为7.75条件下,发酵32 h,1,3-丙二醇质量浓度可达37.16g/L,1,3-丙二醇的生产强度和质量得率分别达到1.16g/(L·h)和52.66%.     

工程菌发酵产酶及其在1,3-丙二醇耦合酶催化制备中的应用

培养定向进化后的质粒保藏菌E.coli BL21(DE3)pLysS/PET-15b-dhaT’-24并进行质粒抽提,将抽提的质粒转化入感受态宿主细胞E.coli BL21(DE3)pLysS中得产1,3-丙二醇氧化还原酶的工程菌。工程菌经乳糖诱导后进行发酵培养获得酶活为182 U/mL的1,3-丙二醇氧化还原酶,最适反应pH值为10,pH值稳定范围为7.0～9.0,最适反应温度为55℃,温度稳定范围为30～45℃。利用工程菌产的1,3-丙二醇氧化还原酶进行转化3-羟基丙醛为1,3-丙二醇的反应,同时偶联甘油脱氢酶(由另一工程菌制备)转化甘油的反应进行辅酶NADH的再生,实现了1,3-丙二醇的双酶耦合的连续反应。由于来源于工程菌的双酶酶学性质相适应,反应连续进行34 h后,底物3-羟基丙醛的转化率达63.4%,产物1,3-丙二醇的产率达64.6%。     

1,3-丙二醇有氧分批发酵动力学模型

在1,3-丙二醇有氧分批发酵中,研究了Klebsiella pneumoniae的生长、底物甘油消耗及1,3-丙二醇的产生特性.基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程,得到了描述1,3-丙二醇有氧分批发酵过程的动力学模型及模型参数,该组模型能很好的拟合发酵过程,并在初始甘油浓度变化较大的范围内表现出很好的适用性.同时所建立的模型也基本反映了Klebsiella pneumoniae分批发酵过程的动力学特征.     

克雷伯氏菌微氧发酵生产1,3-丙二醇的研究

对克雷伯氏菌在厌氧和通1.2L/min空气的条件下间歇连续发酵生产1,3-丙二醇进行了研究,在两种条件下1,3-丙二醇的转化率接近.在通空气的条件下细胞能够正常代谢,并获得较高菌体密度,但有氧发酵的生产强度高于厌氧发酵;甘油处于限制状态、稀释率为0.1h-1的连续发酵中,有氧发酵1,3-丙二醇的转化率和生产强度均高于厌氧发酵.     

克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶发酵条件研究

研究了克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶(甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶)的发酵条件。研究各种碳源、无机氮源、有机氮源及无机盐对产酶的影响,应用均匀设计、神经网络和遗传算法优化发酵培养基组成,结果为(gL-1):甘油30、KCl 1.6、NH4Cl 6.7、CaCl2 0.28、酵母浸膏2.8。在温度37C、初始pH 7.0、摇床转速200rmin-1和接种量5%条件下,发酵24h,无细胞抽提液中甘油脱氢酶、1,3-丙二醇氧化还原酶和甘油脱水酶活力(U·mg-1)分别为9.16、18.72、0.48,发酵34h,发酵液中1,3-丙二醇(1,3-PD)最大浓度为7.96gL-1。代谢过程中关键酶酶活与1,3-PD峰值出现时间不一致,且提早于1,3-PD峰值的出现。此外,结果表明优化后的培养基去除了多种微量元素,克雷伯杆菌生产1,3-丙二醇关键酶可以在微氧条件下进行。     

1,3-丙二醇分批发酵动力学模型

在分批发酵中，研究了Klebsiella pneumoniae的生长、底物甘油消耗及1,3-丙二醇的产生特性. 基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程，得到了描述1,3-丙二醇分批发酵过程的动力学模型及模型参数，该组模型能很好地拟合发酵过程，并在初始甘油浓度变化较大的范围内表现出很好的适用性. 同时，所建立的模型也基本反映了Klebsiella pneumoniae分批发酵过程的动力学特征. 基于分批发酵动力学模型，提出了以甘油为单一碳源时的底物流加策略，通过与其他流加策略条件下的发酵对比实验表明，通过基于动力学模型的流加策略可获得更高的1,3-丙二醇浓度及生产强度.     

克雷伯杆菌有氧发酵利用甘油生产3羟基丙醛的研究

克雷伯杆菌在含有盐酸氨基脲和甘油的磷酸盐缓冲液培养基中有氧发酵,可实现3-羟基丙醛(3-HPA)的转化.考察了影响3-HPA积累和稳定性的一些主要因素,如菌种培养时间、接种量、甘油浓度、盐酸氨基脲、培养温度和pH值.优化后的培养条件为菌种培养时间24 h、接种量2.16 g/L、甘油30 g/L、盐酸氨基脲26.8 g/L、28℃和pH值7.2.在优化条件下培养27 h,发酵液中3-HPA质量浓度达到15.48 g/L,总得率和转化率分别为0.60 g/g和75%.3-HPA低温条件下比较稳定,pH值对其稳定性影响不大.