脯氨酸存在下酪蛋白ACE抑制肽的Plastein反应修饰

利用枯草杆菌碱性蛋白酶水解酪蛋白制备ACE 抑制肽,其IC50 为47.1μg/mL;采用相同酶催化ACE 抑制肽和脯氨酸进行Plastein 反应,对ACE 抑制肽进一步修饰,并用响应面分析法优化反应条件。在ACE 抑制肽质量分数为35%,反应时间为6h,以反应体系游离氨基减少量为指标,得到适宜的反应条件为：温度为47.8℃、脯氨酸比例为0.54、酶添加量为9.5kU/g pro,此条件下体系游离氨基减少量约195.7μmol/g pro。在适宜条件下改变反应时间对酪蛋白ACE 抑制肽进行同程度的Plastein 反应修饰,制备出6 个修饰程度不同的多肽混合物并测定它们的ACE 抑制活性、计算其IC50 值。结果表明：修饰产物的ACE 抑制活性随修饰程度的增加不规则变化,当反应体系的游离氨基减少量为195.7μmol/g pro 时,修饰产物的IC50 降低至0.2μg/mL。     

两步法制备高活性酪蛋白ACE抑制肽的工艺参数研究

为了制备高活性ACE 抑制肽,研究两步法高活性酪蛋白ACE 抑制肽的制备工艺条件参数。利用枯草杆菌碱性蛋白酶55℃水解酪蛋白6h 制备酪蛋白ACE 抑制肽,IC50 为38.6μg/mL;采用相同的酶进行Plastein 反应来修饰酪蛋白ACE 抑制肽,并应用响应面分析法优化修饰反应条件。固定酪蛋白ACE 抑制肽质量分数为35%,以ACE 抑制肽的游离氨基减少量为指标,优化的修饰反应条件为酶添加量7.7kU/g 蛋白质、温度42.7℃、反应时间6h,在此条件下,酪蛋白ACE 抑制肽的游离氨基减少量达到179.72μmol/g 蛋白质。ACE 抑制活性分析结果表明,修饰后ACE 抑制肽的抑制活性显著提高且与修饰反应程度相关,IC50 可降0.5μg/mL。     

酪蛋白水解物的类蛋白反应修饰及其产物ACE抑制活性特征

采用碱性蛋白酶水解酪蛋白,制备水解度为10.9%、IC50值为52.6μg/mL的酪蛋白水解物,并利用响应面法优化碱性蛋白酶催化的类蛋白反应修饰条件。修饰反应时间固定为6h时,适宜的条件为酶添加量3.1kU/g pro、底物质量浓度50g/100mL、反应温度25℃。制备9个修饰程度不同的修饰产物,结果显示：修饰产物ACE抑制活性均提高,并且活性最高的修饰产物的IC50降低至14.9μg/mL。该修饰产物离心分级后,上清液部分和沉淀部分的ACE抑制活性分别低于和高于修饰产物,表明沉淀部分是提高ACE抑制活性的主要原因;Tricine-SDS-PAGE电泳分析表明,修饰产物及沉淀部分有较大分子质量的肽分子生成;该修饰产物和上清液部分、沉淀部分的进一步酶水解处理则显示,酶水解会导致它们的ACE抑制活性降低,但是仍然高于最初的酪蛋白水解物。     

酪蛋白水解物的酶法修饰与ACE抑制活性变化

利用枯草杆菌碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白水解物,其水解度为11.2%,IC50为47.1μg/mL。再应用相同的酶对酪蛋白水解物进行类蛋白反应修饰,考察底物浓度、温度和酶添加量对类蛋白反应的影响,并制备5个不同的修饰产物测定其ACE抑制活性和IC50值。结果表明,修饰产物的ACE抑制活性随修饰程度(游离氨基减少量)的增加而提高,并且都高于未经修饰的酪蛋白水解物。当游离氨基减少量为154.65μmol/g(蛋白)时,修饰产物的IC50值可降至0.6μg/mL。毛细管电泳分析结果显示类蛋白修饰后水解物的多肽组成情况发生明显变化。研究结果证明酪蛋白水解物的ACE抑制活性可以通过类蛋白反应的修饰作用而提高。     

酪蛋白水锯物的酶法修饰与ACE抑制活性变化

利用枯草杆菌碱性蛋白酶水解酪蛋白制备酪蛋白水解物,其水解度为11.2%,IC50为47.1μg/mL.再应用相同的酶对酪蛋白水解物进行类蛋白反应修饰,考察底物浓度、温度和酶添加量对类蛋白反应的影响,并制备5个不同的修饰产物测定其ACE抑制活性和IC50值.结果 表明,修饰产物的ACE抑制活性随修饰程度(游离氨基减少量)的增加而提高,并且都高于未经修饰的酪蛋白水解物.当游离氨基减少量为154.65 μmol/g(蛋白)时,修饰产物的IC50值可降至0.6 μg/mL.毛细管电泳分析结果显示类蛋白修饰后水解物的多肽组成情况发生明显变化.研究结果证明酪蛋白水解物的ACE抑制活性可以通过类蛋白反应的修饰作用而提高.     

酪蛋白水解物的Plastein反应修饰及ACE抑制活性变化

采用中性蛋白酶水解酪蛋白,一定条件下制备水解度为13.0%、IC50质量浓度为40.4 mg/L的酪蛋白水解物。利用中性蛋白酶对所制备出的水解物进行plastein反应修饰,以反应体系的游离氨基量的变化为评价指标,通过单一因素试验研究酶添加量、底物质量分数、反应时间和反应温度对修饰反应的影响。结果表明,适宜的反应条件为中性蛋白酶添加量3 kU/g蛋白质、底物质量分数60%、反应时间6 h、反应温度20℃。制备5个不同反应程度的修饰产物,ACE抑制活性分析结果显示,修饰产物的IC50降至14.7~31.1 mg/L,表明中性蛋白酶催化的plastein反应修饰提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性,且ACE抑制活性的提高程度与plastein反应程度有关。     

乙醇-水相中酪蛋白水解物修饰及对2个性质的影响

利用Alcalase水解酪蛋白,制备水解度为11.6％、IC5值为42.8 mg/L的酪蛋白水解物.在乙醇-水体系中采用Alcalase催化类蛋白反应修饰酪蛋白水解物,固定反应时间6h,优化得到酶添加量、乙醇体积分数、底物质量浓度、反应温度分别为:8.36 kU/g,56.8％,568 g/L,37.5℃.制备不同反应程度的修饰产物,评估其ACE抑制活性及Zn2+螯合能力变化,发现修饰产物的ACE抑制活性得到改善,抑制最高达到62.5％(IC50达到27.7 mg/L),但是与反应程度有关;Zn2+螯合能力则由4.22 mg/g降低至1.97～3.86 mg/g.修饰产物的Zn2+螯合能力与类蛋白反应程度无关,与ACE抑制活性也不存在相关性.     

大米蛋白肽的制备与ACE抑制活性分析

通过优化大米蛋白的单酶酶解与双酶酶解工艺,确定了采用碱性蛋白酶加蛋白酶B复合酶解制备大米蛋白肽的工艺。蛋白回收率高达43.9%,制备的大米蛋白肽感官评价高、苦味低、分子质量小。对比市售的大豆蛋白肽、鱼胶原蛋白肽,3种蛋白肽的水分含量、蛋白质含量、脂肪含量基本接近。大米蛋白肽与大豆蛋白肽中分子质量<2000 Da的总比例均>80%,而鱼胶原蛋白肽中总比例仅有58.01%。这3种蛋白肽均有血管紧张素转换酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制活性,其中大米蛋白肽的活性最高,IC 50最低,为4.97μg/mL,仅为大豆蛋白肽IC 50的21.6%,为鱼胶原蛋白肽IC 50的14.1%。通过结构分析获得的4条大米蛋白肽段序列均符合现有研究的ACE抑制活性的构效分析。测定不同批次生产的大米蛋白肽的ACE抑制活性,结果表明,ACE抑制率与IC 50值基本保持稳定。     

酪蛋白水解物的中性蛋白酶修饰及其ACE抑制活性

采用碱性蛋白酶水解酪蛋白,制备水解度为13.5%、IC50为45.23μg/mL的酪蛋白水解物,然后利用中性蛋白酶对水解物进行类蛋白反应修饰,并研究酶添加量、底物浓度、反应温度和时间对修饰反应的影响。结果表明,修饰反应体系中水解反应占优势,表现为游离氨基含量增加;酶添加量、底物浓度、反应时间对修饰反应的影响显著,而反应温度的影响不大;在低酶添加量、高底物浓度和短反应时间下,修饰反应体系的游离氨基的增加幅度减少,水解反应相对降低。制备6个不同反应程度的修饰产物,ACE抑制活性分析结果显示,修饰产物的IC50降至15.56~19.98μg/mL,表明中性蛋白酶催化的类蛋白反应修饰可以提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性。     

马铃薯蛋白ACE抑制肽的Plastein反应修饰研究

以马铃薯为原料提取马铃薯蛋白,采用胰蛋白酶水解马铃薯蛋白,制备ACE抑制肽,利用类蛋白反应(Plastein反应)修饰获得ACE抑制肽。研究添加氨基酸的种类、酶与底物浓度比([E]/[S])、反应pH、温度和时间5个因素对ACE抑制肽抑制率的影响。结果表明,Plastein反应修饰的最佳条件为:底物浓度30.0%,反应温度43.68℃、pH值8.05、加酶量3 565.05U/g,反应时间3.0h。经Plastein反应修饰,产物的ACE抑制率可以达到(82.89±0.05)%,较未经修饰的提高了1.35倍。     

Modification of Soybean Protein Hydrolysates by Alcalase-Catalyzed Plastein Reaction and the ACE-Inhibitory Activity of the Modified Product In Vitro

Soybean protein hydrolysates were prepared by hydrolyzing soybean protein isolates with a protease alcalase to a degree of hydrolysis of 16.6%, and then modified by alcalase-catalyzed plastein reaction to reveal the impact of plastein reaction on the ACE-inhibitory activity of the modified product in vitro. The suitable conditions of plastein reaction of soybean protein hydrolysates were selected based on the results of response surface methodology with the decreased amount of the free amino groups of the modified product as response. When reaction temperature was fixed at 30°C, the selected conditions were as follows: concentration of soybean protein hydrolysates of 45% (w/w), addition level of alcalase of 275 U/g peptides, and reaction time of 3 to 4 h. Soybean protein hydrolysates and eight modified products were evaluated for their ACE-inhibitory activities in vitro. The assay results highlighted that plastein reaction improved the ACE-inhibitory activity of the modified product. The IC₅₀ of the modified products ranged from 0.64 to 1.11 mg/mL, while that of soybean protein hydrolysates was 1.45 mg/mL. The decreased amount of the free amino groups of the modified product showed influence on the ACE-inhibitory activity in vitro. Analysis results from size exclusion chromatography confirmed that some plasteins with higher molecular weights were formed in the modified product. Our results showed that alcalase-catalyzed plastein reaction could be applied as a potential approach to enhance the ACE-inhibitory activity of soybean protein hydrolysates in vitro.     

大豆蛋白水解物的酶法修饰及其亚铁和钙离子的螯合能力

利用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白制备出水解度为14.1%的水解物,并在醇-水介质中对其进行类蛋白反应修饰。固定底物质量分数30%,反应时间4 h,利用响应面分析法对类蛋白反应条件进行优化,得到最优条件为:酶添加量5.26 kU/g蛋白质,乙醇体积分数56.8%,温度33.1℃。在乙醇-水或甲醇-水介质中制备反应程度不同的修饰产物,并评价其对亚铁和钙离子的螯合能力。结果表明,亚铁离子螯合能力由39.8%提升至59.3%,钙离子螯合能力由62.1%提升至76.6%。大豆分离蛋白的酶解以及类蛋白反应修饰,是一个提高金属离子鳌合能力大豆蛋白螯合肽的新技术。     

高活性酪蛋白抗氧化肽的制备方法研究

采用木瓜蛋白酶对酪蛋白进行水解,得到抗氧化活性较好的酪蛋白水解物,并且水解物在木瓜蛋白酶作用下进行类蛋白反应制备出高活性酪蛋白抗氧化肽。第一步制备酪蛋白水解时酶添加量为500 U/g酪蛋白、温度45℃、底物浓度5%、反应时间2 h。第二步类蛋白反应的最优条件为：酶添加量为500 U/g水解物、温度30℃,底物浓度50%、作用时间5.5 h。毛细管电泳结果确认,类蛋白反应修饰后抗氧化肽的组成情况发生变化。抗氧化活性分析结果表明,类蛋白反应修饰后的酪蛋白抗氧化肽对两种自由基的清除能力显著提高。     

Coupled Neutrase–Catalyzed Plastein Reaction Mediated the ACE-Inhibitory Activity In Vitro of Casein Hydrolysates Prepared by Alcalase

Casein hydrolysates with a degree of hydrolysis of 13.5% were prepared by hydrolyzing casein with an alkaline protease Alcalase, and showed ACE-inhibition in vitro with an IC₅₀ value of 45.2 μg/mL. The hydrolysates were modified by plastein reaction catalyzed by a neutral protease Neutrase to reveal the impact of the coupled Neutrase-catalyzed plastein reaction on the ACE-inhibition of the casein hydrolysates. The effects of addition level of Neutrase, substrate concentration, reaction temperature, and time on the plastein reaction of the casein hydrolysates were studied with the varying amount of free amino groups of the modified hydrolysates as index. The results illustrated that the amount of free amino groups of the modified hydrolysates increased in all occasions, and the addition level of Neutrase, substrate concentration, and reaction time had a clear impact on the plastein reaction. Six modified hydrolysates were prepared at a substrate concentration of 40% (by weight), Neutrase addition level of 3 kU/g peptides, reaction temperature of 35°C, and different reaction time. The assay results highlighted that the coupled Neutrase-catalyzed plastein reaction improved the ACE-inhibition of six modified hydrolysates with IC₅₀ values ranging from 15.6 to 20.0 μg/mL. Size exclusion chromatography analysis showed that some plasteins with a molecular weight of about 68 kDa existed in the modified hydrolysates. The results also demonstrated that it was the coupled Neutrase-catalyzed plastein reaction but not further hydrolysis of casein hydrolysates that enhanced the ACE-inhibition of the modified casein hydrolysates.     

醋蛋水解物的类蛋白反应及对抗氧化活性的影响

先利用胃蛋白酶水解醋蛋液,再添加胃蛋白酶和氨基酸对其进行类蛋白反应,研究反应条件对类蛋白产率的影响和产物抗氧化活性的变化。结果表明,优化类蛋白反应条件为:氨基酸选用色氨酸、色氨酸添加量为1mol/mol水解物游离氨基、底物浓度40%(质量分数)、反应温度65℃、pH6.0、反应时间6h。通过类蛋白反应,醋蛋水解物的抗氧化活性得到很大改善。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,反应前后醋蛋水解物的组成发生变化,有较大分子质量的肽生成。     

鱿鱼肝脏蛋白水解液及ACE 抑制肽的制备

为高效利用鱿鱼及其下脚料肝脏蛋白水解物,采用酶解技术和凝胶过滤分离等技术对鱿鱼肝脏蛋白水解液中抑制肽进行研究。结果表明：胃蛋白酶为鱿鱼肝脏蛋白水解的最佳酶类,同时以水解度和ACE 抑制活性为指标,得出胃蛋白酶水解的最佳条件：在36℃条件下酶解22h,酶与底物的质量比2%,底物质量分数2.5%。经过上述条件处理的水解液再经超滤处理(截留分子质量为20kD)后,用Sephadex G-50 进行分离,洗脱得到5 个峰,其中组分B 的ACE 抑制活性最高,其半抑制浓度(IC50)达到1.80mg/mL。