一种新的类病毒的暗场电镜研究

类病毒(Viroid)是一种仅含有300多个核苷酸的小分子RNA,是有感染性的致病因子,迄今只发现十余种类病毒。暗场电镜成像技术是观察如此微小核酸分子的有效方法。我们应用暗场电镜技术首次观察到苹果锈果病病原体(Apple Scar Skin Viroid)——一种新的类病毒的核酸分子。将纯化的类病毒分子溶在含有0.004％的Benzyldimethylalkylammonium chloride(BAC)中,终浓度为2μg/ml,展层后用敷有厚度为25—50A碳膜的铜网蘸取病毒分子(为增加碳膜的亲水性,先用浓度为30μg/ml的溴化乙啶处理5分钟),再经10~(-4)—10~(-5)M的醋酸双氧铀染色30秒后,在JEM—200CX电镜     

核酸分子的暗场成象

本文扼要地介绍了暗场成象的基本原理和在核酸分子研究中的应用及其优越性。着重叙述和讨论了样品制备的主要环节和倾斜照明法的成象条件。应用暗场电镜技术和不同的制样方法研究了几种核酸和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的核衣壳,并报导了所取得的初步结果。     

用暗场电镜技术观察DNA分子的超螺旋结构

随着拓扑酶的发现和深入研究,人们越来越多地注意到DNA分子的超螺旋结构在DNA复制、RNA转录及其调控过程中的重要的生物学意义。固然,对小分子环状DNA分子,可以经凝胶电泳把超螺旋数不同的分子区分开来,然而核酸电镜技术却能给出更为直观、准确的超螺旋分子的图象,成为超螺旋分子研究的重要实验手段,而暗场核酸电镜技术又较明场技术显出更大的优越性。按常规方法小心提取大肠杆菌质粒DNA PBR_(322)并分别制备用于暗场和明场观察的DNA样品,在     

四膜虫S_1株rDNA的明场与暗场电镜观察

四膜虫(Tetrahymena)是一种单细胞的原生动物。近十几年来,在分子生物学特别是在真核细胞基因的结构与功能的研究中,越来越成为一个重要的实验动物。在四膜虫的大核中,其编码rRNA的基因扩增成上万个游离于染色体的独立的rDNA分子。为此,在对我国自己分离出来的一株四膜虫S_1株rDNA酶切图谱研究的同时,我们用明场和暗场电镜技术观察了它的rDNA的形态与大小,并与国外常用的一种四膜虫T.thermophila做了比较。用热酚法提取四膜虫DNA,经琼脂糖凝胶电泳纯化后的rDNA,按Kleinsehmidt法制备明场电镜样品,其中加质粒PBR322做为标样。暗场样品制备中,用间接真空蒸发法获得的厚约25A的碳膜蘸取样品,染色后,即可在电镜(JEM—200cx)下观察。     

应用免疫吸附电镜技术检测草鱼出血病病毒

免疫吸附电镜技术[ISEM]是免疫学与超微形态学相结合的一种新的检测技术。它快速,灵敏、特异性强,是可靠的病毒诊断技术之一。我们应用免疫吸附电镜技术对草鱼出血病病毒进行了检测,并获得了理想的效果。方法: 将兔抗草鱼出血病病毒血清分别稀释为1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400倍,然后取不同稀释度的抗血清分别滴在蜡盘上,把铜网漂浮在液面上(室温18-20(3)孵化5分钟后,将铜网移至病毒粗制样品中悬浮,室温反应15分钟,捞起吸干,用蒸馏水漂洗,2％PTA染色3-5分钟。同时设酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫复合物及PTA负染色电镜观察作比较。     

一种用于暗场电镜术的超薄碳膜制备方法

高分辨透射电镜术观察单个重原子和未染色生物分子,一个重要问题是底质的背景噪音。利用超薄(20—30A)碳膜做支持物和暗场电子显微术成象较好地解决了这个问题。近年来利用这种技术研究核酸、蛋白质等生物分子.获得了许多新的结构信息。一些作者应用间接蒸发碳到新劈开的云母片,制备较均匀和颗粒性小的超薄碳膜(1、2)。本文介绍了一种简易高效制备超薄碳膜的装置和方法。     

用ESI技术检测病毒中的磷元素

ESI(electron spectrum imaging)技术的创立和展[1][2],使在亚显微水平上对生物体中的特定元素进行定性、定量、和定位检测成为可能。P是构成生命物质的重要元素,我们取有囊膜的Sindbis病毒,初步提纯[3](仍带有细胞碎片)滴在微筛碳膜上,1％醋酸双氧铀负染,使用有计算机图像处理系统的电镜,在P元素L2,3离化能(132eV)前后对样品作ESI成像。用能量损失为E=139eV的图像减去E=117eV的图像得到样品的净磷分布[4]。以病毒核心(core)富含P元素(含于核酸中)为判据,鉴定图1(a)中箭头所指为病毒颗粒。本实验应用乔宝义建立的超薄微筛碳膜技术和ESI技术相结合,用于检测生物样品中的元素分布,具有普遍的应用价值。     

核酸分子的暗场成象

十几年来藉助提高衬度来改善图象分辨率的暗场成象,在核酸,蛋白质及其它生物材料的精细结构研究中已显示出高分辨率的优越性。本文对核酸暗场成象显微术及其观察结果概述如下: 一、暗场照明我们用JEM—200CX型电镜,采取倾斜照明,取中心暗场象(CDF)的工作模式。由于物镜光阑只接收试样少量信息,因而效率较低。而且光阑一侧受强电子束轰击,易造成光阑的非对称污染,因此必须注意象散的校正。     

噬菌体的电镜观察及其图象分析

本文叙述了噬菌体的常用制片和复染技术,对国内多年来所分离到的归属于四科的代表性噬菌体进行了描述。肌尾噬菌体科的地衣芽孢杆菌噬菌体BL2具有头部和尾部,从图1—2中可见到未收缩尾部(图2—A)和收缩尾部(图1—B)的颗粒,收缩的尾部中央暴露出尾管(图1—C)。属于长尾噬菌体科的钝齿棒杆菌噬菌体B275有一不收缩和无尾鞘的尾部,其中一个是充满核酸(左)和一个是释放核酸(右)的颗粒(图10),枯草芽     

GPV和IBRV的超微结构与形态发生的冰冻蚀刻研究

用冰冻断裂技术并结合其它电镜技术,研究了GPV和IBRV囊膜和核壳体的形态和发生。GPV发育早期,病毒从中部断裂,围绕病毒的膜样结构是均匀排列的两层颗粒,而成熟病毒在囊膜中间断裂,说明发育早期的囊膜脂质很少,主要成分是蛋白质颗粒,随后脂质才进入囊膜。而细胞质内成熟GPV囊膜的PF和EF都仍有大量膜内蛋白颗粒,GPV释放到细胞外后囊膜膜内蛋白颗粒大为减少。成熟的IBRV囊膜PF上膜内蛋白比EF上多。在囊膜周缘有时可见剌突样结构。在与疾毒接触的细胞质膜的区域有规则排列的颗粒,似与病毒释放有关。在感染细胞核内同时装配着IBRV的核心、空衣壳和核壳体。细胞核内核壳体固断裂部位不同可分为5种类型,深度蚀刻后对其形态进行了观察。文中还对不同方法制备的样品的形态进行了比较。     

防脱片剂APES制备铜网支持膜的新方法

当前电镜制样普遍采用的支持膜为Formvar膜,但Formvar膜制备过程较为复杂,制作要求比较高。制作的支持膜较薄时,容易被电子束击破或样品发生漂移;较厚时降低了样品的分辨率;制膜时如果湿度过大,膜上会出现许多小“白点”而无法使用。在实际工作中,我们把免疫组化技术工作中的防脱片剂APES(3-amtio propyhri ethoxy silane)应用于铜网支持膜的制备,实验结果表明,样品捞在涂有APES的铜网上,镜下观察,样品无漂移,分辨率好。经过两     

用高压电镜与立体视镜观察整装细胞内病毒与细胞骨架的关系

以前,我们曾发现牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)可诱导大量对松胞素B不敏感的微丝,而且病毒的释放与微丝结构有某种关系。在此基础上,我们用整装电镜技术对细胞骨架与成熟病毒的关系做了进一步地探讨。将牛肾次代细胞培养在敷有方华膜和鼠尾胶膜的金网或镍网上,接种病毒24小时后,在室温下用戊二醛和锇酸固定细胞,并用醋酸双氧铀染色1小时,再经脱水和临界点干燥后,于日本JEM—200CX电镜下观察,加速电压200KV,同一视野以8度之差,拍摄二张照片,用于立体视镜观察。正常牛肾细胞的边缘,细胞质膜完整,骨架系统层次分明,线粒体等细胞固定在细胞骨架网络上。在IBRV感染的细胞中,细胞骨架发生了明显的变化,其层次减少,微丝束增多,分布似乎更有方向性。许多区域细胞质     

沙眼衣原体DNA的电镜观察

核酸分子电镜已成为分析基因结构和功能的一个重要工具,随着遗传工程技术的发展已获得进一步的应用。我们以沙眼衣原体DNA为样品,对核酸分子电镜技术作了摸索。经鸡胚卵黄囊培养增殖的TE55株沙眼衣原体,超速离心钝化,SDS和蛋白酶K破坏囊膜蛋白,酚抽提,氯仿沉淀三次,样品经琼脂糖淀胶电泳分析为一条区带。     

一种制备冷冻含水生物样品的快速冷冻装置

长期以来,低温电子显微学被视为生物电子显微术中最有希望得到生物自然结构的手段。八十年代由Ad-rina等(1984)实现并迅速开展于世界许多著名实验室的在微筛支持膜上制备玻璃态含水生物材料的方法推动了生物大分子结构电子显微学研究接近原子分辨水平。利用这种制样方法,加一套减少电子辐射损伤的电镜技术和相位衬度成像方法,可获得较高分辨率的生物大分子结构像和晶体衍射花纹。若干报导冰包埋蛋白质晶体样品的电子衍射可记录到近3埃的信息。此种制样方法已广泛地用于蛋白质、核酸以及蛋白质一核酸复合体的单体、薄晶的形态结构研究中(Dubochet J.等1988)。     

电镜核酸分子原位杂交技术的探索

显微水平的核酸分子原位杂交技术已广泛地应用于基因在染色体上的定位,发育过程中的基因表达等方面,但电镜水平的原位杂交技术却仍在探索之中,主要因为剧烈的核酸分子杂交条件与样品精细结构的保存之间存在着矛盾,为此,我们分别在分级抽提的整装细胞,L-K_4包埋或Epon812包埋的超薄切片样品以及DGD包埋-去包埋样品中对进行电镜分子原位杂交研究的可行性和杂交条件进行了一些探索,目前在整装细胞样品中已取得初步的结果。     

静电泳动核酸电镜技术

根据核酸的分子结构及物理性质,我们设计了静电泳动制备核酸电镜样品的方案,进行了一系列试验,认为这种方法是可行的。核酸溶液PH值在大于其等电点时,分子带大量的负电荷,在电介质纯水中,由于外加静电场的作用,就会沿着电场力的方向进行泳动。我们采用柞蚕核型多角体病毒DNA和松毛虫质型多角体病毒RNA作为材料,分别将核酸样品稀释为0.5-1μg/ml的水溶液(pH7-7.5),将此溶液吸取50微升滴在光滑的蜡板上,形成半球形液珠。将蜡板移置于SBC-2喷镀仪的离子溅射钯和地之间,即平行板电极间。设上、下平行板间的距离为l,板间电压为V,加电压作用时间为t。分别以三个量中的两个量作为     

人类腹泻粪便中小圆形病毒的电子显微镜研究

我们在研究婴幼儿急性胃肠炎和腹泻及成人流行性腹泻的病原学时,用直接电镜和免疫电镜技术,从患者粪便标本中检出了4种小圆形病毒颗粒。粪便标本用生理盐水制成20～50％的悬液(水样便可不稀释),经超声波粉碎处理(振幅4μ,每次30秒钟,共3～5次),3000rpm离心30分钟,上清为被检样品。被检样品制备直接电镜或免疫电镜标本,用3％磷钨酸(pH6.4)做负染色。     

四氧化锇(OsO_4)固定剂的二次利用

四氧化锇(OsO_4)用于生物样品的固定,已经证明是一种极为有效的固定剂。迄今为止还没有一种可以取代四氧化锇的固定剂,因此在电镜生物样品的制备过程中早已被普遍的使用。但是由于四氧化锇的价格十分昂贵,对四氧化锇的重复使用,高效益的发挥它的作用,用于在教学和科研中,降低实验成本并获得良好的实验结果是本文研究解决的目的。我们通过收集OsO_4的用过液(已用于生物样品固定的OsO_4溶液),经过氧化—还原处理,得到锇酸盐晶体,进一步得到纯化的OsO_4,重新配制成一定浓度的OsO_4溶液,用在教学和试验中获得了满意     

家蚕传染性软化病病毒RNA的电镜研究

家蚕传染性软化病病毒(Infectious Flacherie Virus,IFV)国际上已进行了多年研究。根据其各种理化性质的分析测定,确认它属于微RNA病毒科。1985年,证明其RNA上结合着被称为VPg的蛋白质,这是微RNA病毒科所属病毒的特征之一。IFV的核酸为单键RNA,分子量经超离心法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定为2.6×10~6道尔顿。但有关这种RNA构形,国际上至今尚未见报告。我们运用电镜技术对从病毒粒子中抽提的IFV—RNA进行了观察分析,并且使用EDTA和尿素对病毒进行处理,让RNA从病毒粒子中直接释放后用电镜进行了研究。     

石蜡切片的扫描电镜观察方法

电子显微镜使人们能够用眼睛直观的看到从亚细胞结构的细节到微小的病毒,甚至原病毒颗粒,从核酸蛋白质的生物大分子到小分子甚至原子的形态结构。但美中不足的是,由于微小样品在高放大时的视野局限性以及透射电镜对样品厚度的超薄要求,使得电镜(透射)照片所形成的微小视野平面图像给人们直观了解生物亚显微结构的三维联系和形态与功能的相关分析带来了困难。为补尝这个不足,我们对石蜡切片的扫描电镜观察方法进行了新的探讨。