单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅱ的分离纯化及其酶学性质

目的分离纯化单一组分的单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅱ,并分析其酶学性质。方法单环刺螠体腔液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶过滤等方法进行分离纯化,得到单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE、SDS-PAGE和飞行质谱分析,测定其纯度和相对分子质量;并以酪蛋白为底物,Folin-酚试剂法测定酶活力,对其酶学性质进行分析。结果分离纯化的UFE-Ⅱ具有水解纤维蛋白的活性,其水解酪蛋白的比活力达到375.6U/mg,纯化倍数为10.3倍,回收率为14.0%。UFE-Ⅱ为单一组分,纯度达99%以上,相对分子质量为24329。UFE-Ⅱ的最适反应温度约为45℃;最适反应pH值为7.0;Ca2+、Mn2+和Fe2+是该酶的强激活剂;Fe3+、Cu2+和Pb2+对该酶活力具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF能完全抑制酶活力,表明该酶为丝氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制剂可部分抑制酶活力,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒可较弱地抑制酶活力。结论从单环刺螠体内成功分离纯化出纤溶酶UFE-Ⅱ,并分析了其酶学性质,该酶具有进一步开发利用价值。     

高强度耐有机溶剂蛋白酶的纯化及性质

分离纯化了自行筛选的耐有机溶剂的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis YP1所产的溶剂稳定性蛋白酶. 发酵液经硫酸铵沉淀、疏水层析及强阳离子交换层析纯化,得到电泳纯的蛋白酶;分子量约为28 kDa,纯化蛋白酶的比酶活达到1.18′105 U/mg,纯化倍数为37.2,酶活回收率为20.8%. 纯化的YP1蛋白酶对50%(j)的多种亲水或疏水有机溶剂具有很高的耐受性,其中50%(j)的DMF和DMSO能显著促进YP1蛋白酶活力. YP1蛋白酶为Zn2+蛋白酶,最适反应温度为55℃,最适反应pH为10.0,pH 8.0~13.0范围内具有高活力. 以酪蛋白为底物,YP1蛋白酶的米氏常数Km为0.048 g/L.     

沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株的筛选及其酶学性质

目的从海洋生物双齿围沙蚕消化道筛选产蛋白酶菌株,并对其胞外蛋白酶的性质进行分析。方法用脱脂奶粉平板溶圈法及改良Lowry法进行产蛋白酶菌株的筛选和蛋白酶活力测定;Bradford法测定蛋白含量;UVP GDS8000型凝胶成像系统和VisionWorks、Bandscan4·03软件进行相对分子质量和纯度分析,并对酶的各项性质进行检测。结果筛选出高蛋白水解活性菌株D2,其胞外蛋白酶比活性为156·0U/mg,相对分子质量约为42000,纯度大于97%,最适作用温度60℃,最适pH为9,在pH6～10及0～55℃具有较好的稳定性。结论D2株分泌的胞外蛋白酶有望成为一种新型的海洋微生物蛋白酶资源。     

Kitasatospora sp.MY 5-36中e-聚赖氨酸降解酶的纯化及酶学性质

对Kitasatospora sp. MY 5-36中e-聚赖氨酸降解酶(PLD酶)进行了纯化和酶学性质研究. 通过DEAE-Sepharose, Source 15Q, Mono Q三步阴离子交换层析从细胞中得到纯酶，收率达40.7%，纯化倍数为500倍. 经SDS-PAGE电泳、凝胶过滤层析检测PLD酶由2个同聚亚基组成，亚基和全酶相对分子量分别为43.6和87.0 kDa. PLD酶的最适反应温度为30℃，最适pH值为7.0, 20~40℃保存时酶活力稳定，50~60℃保存时酶活力迅速下降，最大反应速率Vmax=0.112 mmol/(L×min), 米氏常数Km=0.216 mmol/L. PLD酶是一种金属酶，能够被Co2+激活、被Ca2+抑制.     

酸性蛋白酶AP-10分离纯化及其酶学性质

采用活性炭吸附脱色、硫酸铵分级沉淀、脱盐和凝胶层析等技术对酸性蛋白酶AP-10浓缩液进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。结果表明,分离纯化后得到的酸性蛋白酶AP-10纯组分比酶活为5 800 U·mg^-1,纯化倍数为6倍;最适反应温度为40℃,热稳定范围为30～45℃;最适反应pH值为3.0,pH值稳定范围为3.5～6.5;Mn²⁺对酸性蛋白酶AP-10具有强烈的激活作用,Fe²⁺对酸性蛋白酶AP-10具有强烈的抑制作用。为拓展酸性蛋白酶AP-10的应用及开发高品质产品奠定了基础。     

灵芝超高压突变株漆酶的纯化和酶学性质

灵芝超高压突变株G1502的发酵液经浓缩、DEAE-纤维素柱层析,纯化出一种漆酶。其最适作用温度为45℃,在不高于45℃的条件下保存5 h,残余酶活在97%以上;最适pH为4.4,在pH=3.8~6.6内保存,残余酶活在80%以上。漆酶催化愈创木酚的υmax和Km分别为2.28μmol.L-1.min-1和1.94×10-4mol.L-1。金属离子K+和Cu2+对酶有激活作用,Fe2+、Co2+、Ca2+、Na+、Ba2+对酶活有很大的抑制作用。     

一株产酯酶菌的分离鉴定及其酶学性质研究

从土壤中分离得到一株产酯酶菌,经16S rDNA序列测定,属于嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),命名为S.mal SF-H。对该菌株产酶的诱导效应及其酶学性质进行了研究。结果表明,培养基中加入5g·L~(-1)柠檬酸三正丁酯塑化剂,可以有效诱导该菌株产生酯酶,所产酯酶对短链脂肪酸酯的水解活性有明显底物特异性和差异性。以对硝基苯乙酸酯为底物时,酶液表现出良好的耐温性,最适温度为80℃,且70℃保温2h的相对酶活力为95%,最适pH值为9.0,在pH值为8.0时稳定性最好;以对硝基苯丁酸酯为底物时,酶的最适温度为70℃,70℃保温2h的相对酶活力为51%,最适pH值为8.0,在pH值为8.0~10.0时稳定性最好。所产酯酶的耐溶剂性表现基本一致,在66%丁醇和66%乙醇中相对酶活力均约为60%。     

乙醇脱氢酶的初步分离及其酶学性质的研究

以硫酸铵为沉淀剂,采用盐析法对乙醇脱氢酶（ADH）进行了初步的分离纯化,ADH比活力从粗酶液的0.464 U·mg^-1提高到1.198 U·mg^-1,纯化倍数为2.582。研究了ADH的基本酶学性质,其最适作用pH值为7.0-10.0,pH值为8.0时酶活力达到最大,pH值为7.0时酶较为稳定;最适作用温度为37℃,温度为30-40℃时酶活力较为稳定,温度超过45℃后酶活力急剧下降。     

里氏木霉LW1产纤维素酶的酶学性质

研究了里氏木霉LW1所产纤维素酶的主要酶学性质。结果表明,该纤维素酶的最适温度为50℃,最适pH值为4.8;在30～50℃,pH 4.0～6.0范围内有较高的稳定性;90℃处理15 min,酶粉的CMC酶活和FPA酶活保存率分别为38.66%和52.68%;Ca2+、K+、Na+、Mg2+离子对酶活有激活作用,Mn2+、Zn2+、Cu2+离子有抑制作用。     

聚合松香铜对漆树漆酶的固定化研究

以聚合松香(PR)为原料,分别与Cu2+、Ca2+、Ni2+和Mg2+等4种金属离子反应制备相应配合物,再对漆树漆酶进行固定化,得固定化酶PRCuEn、PRCaEn、PRNiEn、PRMgEn,考察了固定化酶的性能.结果表明,4种固定化酶均具有较好的重复使用性,其中PRCuEn使用5次后,相对活力为53.6%;以愈创木酚为底物时,PRCuEn的最适温度为40～45℃(较游离酶高5～10℃),其最适pH值为5.0(较游离酶最适pH值9.0明显向酸性偏移).     

一种溶解酶(ATE)的分离纯化及其稳定性

An antithrombus enzyme (ATE) was precipitated by (NH4)2SO4 or ethanol from supernatant of Bacillus subtilis culture broth then purified using ion exchange chromatography on CM-sepharose fast flow. The effects of ionic strength and pH value on protein adsorption, the gradient elution at different flow rates and step elution were examined respectively. The recovery yield of the optimised process was 74.5% with a purification factor 8.1. The ATE molecular weight was estimated as 30ku by SDS-PAGE. The experimental results showed that the enzyme was stable in the range of pH 7 to pH11, and temperature 25℃ to 37℃.     

产芽孢梭菌纤溶酶的纯化及特性

目的 从产芽孢梭菌的培养上清中分离纯化出具有纤溶活性的蛋白质。方法 以产芽孢梭菌的培养上清为材料，经过滤、硫酸铵盐析、离子交换层析纯化纤溶酶，并对其理化特性和纤溶活性进行鉴定。结果 所分离纯化的纤溶酶相对分子质量为67000，系由相对分子质量45000和20000的2个亚基组成，具有较强的溶解纤维蛋白的作用。此酶属丝氨酸蛋白酶类，胰蛋白酶类。结论 为纤溶酶的开发和应用提供了依据。     

无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立

目的建立适合大规模生产的无细胞百日咳疫苗(Acellular pertussis vaccine,APV)纯化新工艺,使疫苗主要成分的比例稳定可控。方法复苏百日咳菌种并传代培养,在大罐发酵培养收获前,调整菌液的pH值至弱酸性,再通过离心获得上清液,经超滤浓缩和脱盐处理,使用阳离子交换层析进行目的组分的分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE分离并经Western blot鉴定,确定最佳纯化条件。用建立的层析纯化新工艺连续纯化3批APV,检测各项指标,验证该工艺的重复性。结果收获前菌液pH值调至5.8～6.0,可使疫苗主要保护抗原在上清液中的含量明显提高;采用强阳离子交换层析的方法,从目的蛋白的捕获到多组分的分离提纯可一步完成,各目的蛋白组分的纯度均可达85%以上,回收率可达90%以上;建立的纯化新工艺具有良好的重复性。结论初步建立了可线性放大、适合APV大规模生产的层析纯化新工艺,为疫苗质量标准的提高奠定了基础。     

重组人uPA_(17)-KPI大规模发酵及纯化工艺的建立

目的建立重组人uPA17-KPI(rhuPA17-KPI)毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺。方法对工程菌表达rhuPA17-KPI的pH值进行优化。在摇瓶中制备rhuPA17-KPI工程菌种子2L,接种至80L发酵罐中,采用优化的pH值,补料分批培养方式对工程菌进行高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,经甲醇诱导48h后结束发酵。将发酵液离心,经SP Sepharose XL阳离子交换层析和SourceTM 30 RPC反相疏水柱层析纯化。结果建立的发酵工艺为:控制发酵温度为28℃,pH值为5.5,溶氧值为25%～30%之间,在酵母细胞湿重达到190g/L时开始甲醇诱导表达,诱导30h,rhuPA17-KPI的分泌达高峰,为300mg/L发酵液。发酵上清经阳离子交换层析和反相疏水层析纯化后,获得纯度为95%以上的rhuPA17-KPI,产量为180mg/L,回收率为60%。结论已建立了rhuPA17-KPI毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺,为其产业化及临床应用奠定了基础。     

重组G145R HBsAg亲和纯化方法的建立及其应用

目的建立重组乙型肝炎病毒G145R变异HBsAg抗体亲和纯化方法。方法用抗-HBs单克隆抗体(D12- McAb)制备亲和层析胶,对2A8细胞(分泌G145R变异HBsAg)培养上清盐析物进行亲和纯化。采用SDS-PAGE、Western blot及ELISA,对纯化产物的纯度、特异性、含量和回收率进行鉴定,并与同法纯化的HBsAg阳性血清及r-wHBsAg提取物进行比较。结果D12-McAb对重组真核表达G145R变异HBsAg、HBsAg阳性血清及r-wHBsAS三者具有相似的亲和性,产物纯度分别为90.3%、95.2%和93.1%,回收率分别为43.3%、72.0%和66.4%。结论已成功地建立了重组G145R变异HBsAg抗体亲和纯化方法,为G145R变异以及其他HBV免疫逃逸变异感染的深入研究奠定了重要的技术基础。     

杨树菇中一种脱氧核糖核酸酶的纯化及其性质

目的分离纯化杨树菇子实体中脱氧核糖核酸酶,并对其性质进行分析。方法通过80%饱和(NH4)2SO4沉淀、Blue Sepharose 6 Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow和SP-Sepharose Fast Flow层析方法,从杨树菇子实体中分离纯化一种脱氧核糖核酸酶。SDS-PAGE和活性SDS-PAGE测定相对分子质量,采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法分析其酶学性质,并检测pH、温度、Mg2+和EDTA浓度对酶活性的影响。结果经纯化得到了一种脱氧核糖核酸酶,其相对分子质量为31000。该酶对超螺旋质粒DNA、λDNA、ssDNA和dsDNA均具有降解活性,对dsDNA的降解活性略高于ssDNA,且酶活性依赖于二价金属阳离子。该酶的最适pH值范围为7.5～9.6,50℃时相对酶活性最高。结论从杨树菇子实体中纯化的脱氧核糖核酸酶属于一种非限制性脱氧核糖核酸内切酶。     

人α_1型基因工程干扰素的中间试制

带有杂交质粒pBV867的大肠杆菌BMH 71-18株,用高密度发酵培养法进行发酵,3批中试的平均菌产量为100.25克/升,粗制干扰素的表达量平均为8.39mg/升。3批粗制干扰素的数量分别为35000,30000和36000 ml。经初步提纯,分别浓缩10.4、10和11.29倍,比活性上升10、33和30倍,初步提纯的得率为34.33％。经高度提纯、浓缩23.8、16.7和26.1倍,比活明显增加至24.38、20.80和21.43×10~6 IU/mg蛋白,平均得率为35.92％,总得率为11.82％,平均提纯倍数为1757倍。 3批中试产品按WHO规程的标准进行检定,经SDS-PAGE银染色法测定,呈一条带,其分子量约为21000,无论在还原或非还原的条件下干扰素纯度均在95％以上。用HPLC检定均为单一峰形,纯度在95％以上。其它检定项目如等电聚焦、效价、热原、残余DNA、鼠IgG含量测定和全波长扫描等均合乎规程要求。     

Purification of recombinant Pfu DNA polymerase using a new JK110 resin

The purification of recombinant Pfu DNA polymerase expressed inEscherichia coli was studied. The lysed supernatant was heated to 75 ‡C to denature E. coli protein, followed by chromatography on JK110 and Sephadex G-75. The purified protein had comparable activity to the commercially obtained Pfu in both DNA polymerase and PCR amplification. The final product had a specific activity of 17,600 U/mg and 149,600 U of Pfu DNA polymerase was obtained from 500ml culture. JK110 has worked well in our study and appears to be a new method of choice for purification of Pfu DNA polymerase.     

葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的重组表达及一步纯化

从绿色木霉中克隆了葡萄糖苷酶bg基因,构建入表达载体pPIC9k-His6中,然后在AOX1启动子的控制下,在毕赤酵母GS115菌株中表达. 在5 L发酵罐中发酵120 h,重组P. pastoris Mut+菌株湿重达360.6 g/L,葡萄糖苷酶浓度和酶活分别为2.1 mg/mL和73.5 U/mL. 经亲和层析一步纯化后,得到了电泳纯的葡萄糖苷酶. HPLC分析显示其纯度为95.6%,比酶活为71.9 U/mg. 纯化过程酶得率为73.6%,纯化倍数为42.6. 纯酶的等电点为5.0,最适温度为50℃,最适pH为6.5. 金属离子Ag+, Ca2+, Cu2+, Fe2+及SDS对葡萄糖苷酶活性有抑制作用,而Mg2+, Mn2+, K+能增强葡萄糖苷酶活性,其中1 mol/L Mg2+能使酶活提高20%.