细胞色素P450BM-3热稳定性的半理性改造

为了提高细胞色素单加氧酶P450 BM-3的热稳定性,采用半理性设计策略对该酶进行了分子改造。首先采用B-FITTER软件分析了P450 BM-3晶体结构中各氨基酸残基位点的温度因子(B-factor),识别出了一个对酶的热稳定性有不利影响的关键氨基酸残基位点G46,然后以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G)为亲本酶在该位点进行定点饱和突变构建了突变文库,并从饱和突变文库中筛选获得了一个热稳定性得到显著提高的突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G/G46S)。该突变酶(G46S)的半失活温度(T5010)比亲本酶提高了5℃(达到48℃;在50℃的半衰期t1/2比亲本酶延长了一倍。同时,突变酶的酶学性质也得到明显改善,与亲本相比,突变酶Km降低了22%,kcat提高了90%,催化效率kcat/Km(67.42 L?(mmol?min)-1)比亲本提高了1.48倍。这说明G46位点不仅影响酶的热稳定性,还影响酶对底物的结合与催化性能。G46S突变酶的获得表明,只要采用适当的半理性设计策略对正确的位点进行分子改造,可以在提高酶的热稳定性的同时,保持或甚至提高酶的催化活性。     

定点突变提高菜豆环氧水解酶的对映选择性

为了提高菜豆环氧水解酶(PvEH1)催化对氯环氧苯乙烷(pCSO)的对映选择性,利用定点突变构建了PvEH1~(W102L)、PvEH1~(P137K)及PvEH1~(I151V)三种突变体,分别研究了突变体全细胞动力学拆分rac-pCSO的催化特性,优化了PvEH1W102L动力学拆分rac-pCSO的初始底物浓度及反应时间,通过分子模拟分析了PvEH1~(W102L)对映选择性提高的机理。结果表明,最优突变体PvEH1~(W102L)的E值为25.5,相对酶活为212.6%,分别是PvEH1的11.6倍与2.1倍;PvEH1~(W102L)动力学拆分150 mmol·L~(-1) rac-pCSO,反应4 h后,可获得(R)-pCSO(产率为45.62%,ees为96.30%)和(R)-对氯苯基乙二醇(产率为50.91%,eep为90.26%)。分子模拟结果分析表明,PvEH1的102位色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)降低了酶与(R)-pCSO的结合能力,从而提高了PvEH1~(W102L)对pCSO的对映选择性。     

双波长叠加紫外光度法测定SDBS

研究了硫酸耐尔蓝与十二烷基苯磺酸钠(SDBS)的反应,建立测定SDBS的双波长叠加紫外光度法。在pH=5.02缓冲溶液中,硫酸耐尔蓝与SDBS形成离子缔合物,在紫外区有正、负吸收峰,大正吸收波长位于304 nm,大负吸收波长位于280 nm,摩尔吸光系数分别为ε280为2.5×104L·mol-1·cm-1,ε304为2.2×104L·mol-1·cm-1,当用双波长叠加法时,ε280+304为4.7×104L·mol-1·cm-1,线性范围均为0.5~4 mg/L。研究了反应的适宜条件,用于环境水中SDBS的测定,回收率在98.9%~103.2%。     

糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性

以N-糖基化提高毕赤酵母重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)的热稳定性为目的,在PGUS-P模拟结构分析的基础上,半理性方法设计并通过定点突变引入具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列特征的新N-糖基化位点,经毕赤酵母重组表达后,获得了3个新糖基化的突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259。反应动力学分析表明,与原始PGUS-P相比,突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259催化甘草酸水解的Km变小,Kcat/Km增加,表明其对底物甘草酸的亲和力和催化效率均得到提高。热稳定性分析表明,PGUS-P-35和PGUS-P-259的热稳定性得到改善,在65℃下保温90 min,其热稳定性相对PGUS-P分别提高了13%和11%。研究表明在蛋白质的合适位点引入糖基修饰对提高蛋白的热稳定性具有促进作用。     

氨基酸突变对细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的影响

利用饱和定点突变技术对细胞色素P450 BM-3（A74G/F87V/L188Q）（PT）的168和435氨基酸位点分别进行随机突变,根据其羟基化吲哚生成的靛蓝在670nm处具有特殊吸收峰进行高通量筛选,获得了三个高于亲本酶（PT）的突变酶D168H、D168L和E435T。通过考察突变酶反应动力学参数、电子耦合率、热稳定性、最适pH以及区域专一性的变化情况,发现相对亲本酶而言所有的突变酶对底物吲哚的亲和力和催化效率都得到了不同程度的提高,其中突变酶D168H的kcat值比亲本酶提高了3倍多;突变酶D168H的电子耦合率比亲本酶大约降低了2倍,而突变酶D168L和E435T的电子耦合率却有轻微的提高;所有突变酶均在pH8.2附近表现出最大羟基化吲哚生产靛蓝的能力;突变酶D168H对吲哚的区域选择性得到了提高,主产物靛蓝从亲本酶的72%提高到了93%。另外,热稳定性实验表明：尽管突变酶D168H和D168L的热稳定性较亲本酶有所降低,但活力的大幅度提高并未对酶的热稳定性造成大的伤害。以上所有的结果为了解细胞色素P450 BM-3结构与功能关系提供了有用的信息,同时为进一步定向进化P450BM-3提高其功能特性提供了进化模板。     

尿素对磺酰脲除草剂与过氧化氢酶相互作用的影响

应用荧光光谱法研究了水溶液中尿素对氯磺隆、甲磺隆与过氧化氢酶分子间的结合反应的影响.结果表明,两种除草剂对过氧化氢酶的荧光均有较强的猝灭作用,且形成复合物所产生的静态猝灭是引起过氧化氢酶荧光猝灭的主要原因.进一步根据荧光猝灭结果确定了除草剂-酶复合物的形成常数和结合位点数.未添加尿素时,氯磺隆K=8.69×105 L·mol-1,n=1.16;甲磺隆K=1.01×106 L·mol-1,n=1.21.添加尿素混用后,氯磺隆K=2.82×106 L·mol-1,n=1.08;甲磺隆K=3.63×107 L·mol-1,n=1.14.并根据能量转移机制,求出了氯磺隆、甲磺隆及其与尿素混用等四种情况下,给能体和供能体间距分别为5.60 nm、4.26 nm、3.69 nm、3.65 nm.由此可见,两种除草剂与过氧化氢酶的结合作用在未添加尿素时,甲磺隆大于氯磺隆;添加尿素后,甲磺隆和氯磺隆与过氧化氢酶的结合作用增强.     

吡啶为助剂合成甲酸甲酯的动力学研究

在60～90℃对以吡啶为助催化剂由一氧化碳合成甲酸甲酯的反应进行了动力学研究。结果表明该反应为2级反应,速率方程rυ=-dpco/dt=k[MOH]pco,无助催化剂时反应活化能Ea=67.63kJ/mol,反应速率常数k=9.66×106exp(-67.63×103/RT)(mol-1·L·min-1);当有助催化剂存在时,反应活化能为Ea=61.19kJ/mol,反应速率常数k=8.82×106exp(-61.19×103/RT)(mol-1·L·min-1)。并对助催化剂吡啶的助催化机理进行了探讨。     

一个有利于细胞色素P450BM-3催化吲哚合成靛蓝的三位点突变酶:D168L/E435T/V445A

为进一步提高P450 BM-3催化吲哚合成靛蓝的能力,在前期获得的突变酶D168L/E435T基础上引入V445A突变,获得突变酶D168L/E435T/V445A,该突变酶与D168L/E435T及V445A相比,对吲哚的亲和力分别降低41.5%及35.8%,转化数(kcat)分别提高1.61倍及1.31倍,催化效率(kcatKm-1)分别提高1.53倍及1.47倍;该突变酶对电子的耦合率也提高至24.7%,较D168L/E435T提高39.5%,较V445A提高64.7%,说明该突变酶在电子的利用率上有明显改善;此外,该突变酶催化副产物靛玉红的比例大幅降低,降低为D168L/E435T的41.7%及V445A的30.6%,说明该突变酶催化吲哚的区域选择性上也更加有利于靛蓝形成。     

一个有利于细胞色素P450 BM-3催化吲哚合成靛蓝的三位点突变酶：D168L/E435T/V445A

为进一步提高P450 BM-3催化吲哚合成靛蓝的能力,在前期获得的突变酶D168L/E435T基础上引入V445A突变,获得突变酶D168L/E435T/V445A,该突变酶与D168L/E435T及V445A相比,对吲哚的亲和力分别降低41.5%及35.8%,转化数（k_cat）分别提高1.61倍及1.31倍,催化效率（k_catK_m^-1）分别提高1.53倍及1.47倍;该突变酶对电子的耦合率也提高至24.7%,较D168L/E435T提高39.5%,较V445A提高64.7%,说明该突变酶在电子的利用率上有明显改善;此外,该突变酶催化副产物靛玉红的比例大幅降低,降低为D168L/E435T的41.7%及V445A的30.6%,说明该突变酶催化吲哚的区域选择性上也更加有利于靛蓝形成。     

荧光光谱法研究盐酸二甲双胍与牛血清白蛋白的相互作用

采用荧光光谱法研究了盐酸二甲双胍与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用以及常见金属离子对盐酸二甲双胍和BSA相互作用的影响。在λex=282nm、λem=340nm的条件下,测定了不同温度下盐酸二甲双胍对BSA的荧光猝灭光谱以及铜离子、镁离子存在下的荧光猝灭光谱。根据Stern-Volmer方程求得563K、567K、571K时盐酸二甲双胍与BSA相互作用的动态猝灭常数KSV分别为7.212L·mol-1、7.926L·mol-1、9.227L·mol-1,动态猝灭速率常数Kq分别为7.212×108 L·mol-1·s-1、7.926×108 L·mol-1·s-1、9.227×108 L·mol-1·s-1,相互作用的热力学参数ΔG、ΔH、ΔS的平均值分别为-5.32kJ·mol-1、23.95kJ·mol-1、95.64J·mol-1·K-1,结合常数Ka分别为3.75L·mol-1、4.90L·mol-1、12.63L·mol-1,结合位点数n的平均值为0.9206,在金属离子存在下,KSV和Ka均降低。表明,盐酸二甲双胍对BSA的荧光猝灭为动态猝灭且二者之间的相互作用力为疏水作用力,金属离子的存在不利于盐酸二甲双胍与BSA的结合,削弱了盐酸二甲双胍与BSA的相互作用。     

硫酸氢钠催化合成乙酸乙酯动力学研究

在间歇反应釜中以硫酸氢钠为催化剂,乙醇和乙酸为原料催化合成乙酸乙酯。在消除内外扩散影响的前提下,以初始速率法回归动力学方程。在催化剂过200目分子筛,实验转速为200 r/min条件下,反应内外扩散可以消除。在实验范围内获得动力学方程参数为:活化能33609.35 J.mol-1,指前因子k0=24874.29 mol-1.L·min-1,反应动力学方程为:-rA=(0.0657x-0.00746)×2487.29×e-33609.35/RT×(CACB-CECW/3.51)。     

槲皮素-罗丹明6G荧光猝灭体系研究

以Stern-Volmer方程和罗丹明6G吸收光谱研究了槲皮素-罗丹明6G荧光猝灭体系。结果表明,槲皮素、罗丹明6G间发生静态猝灭,生成稳定复合物,二者的结合常数和结合点数为k1=2.63×106L·mol-1,n1=1.14;k2=7.42×105L·mol-1,n2=1.07。槲皮素的质量浓度在0.01～0.2μg·mL-1和0.2～5.0μg·mL-1范围内与F0/F成正比,检出限为5.9ng·mL-1,加标回收率为91.7%～104%,方法可用于槲皮素含量测定。     

丁二酸二异丙酯的合成及其动力学研究

采用3A分子筛吸附脱水技术,以阳离子交换树脂NKC-9为催化剂、丁二酸和异丙醇为原料合成丁二酸二异丙酯。考察了醇酸摩尔比、催化剂用量和反应时间等因素对反应转化率的影响,并测定了动力学数据。结果表明较佳酯化反应工艺条件为:n(异丙醇)∶n(丁二酸)=3.5∶1,阳离子交换树脂NKC-9的用量为异丙醇和丁二酸总质量的9%,在温度不高于100℃条件下反应2 h。较佳反应条件下丁二酸的转化率为99.16%。反应总级数为二级,表观活化能为73.4 kJ·mol-1,指前因子为1.62×107L·mol-1·min-1。     

定向进化转录调节基因提高漆酶异源表达

为提高Tremetes viscolor漆酶Lcc的表达量,本研究主要针对漆酶转录调节区域进行定向进化。利用易错PCR,选择不同浓度的Mn2+对调节区域进行突变,并以酿酒酵母为宿主细胞进行异源表达,构建S. c/pYES2-Lcc调节子突变库。选用2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)为底物的96孔板测定漆酶酶活高通量筛选方法对突变库中960株突变体进行筛选,并对酶活高的突变体进行摇瓶复筛,最终获得三株遗传稳定性良好的酶活较高地突变体M1、M2、M3,其粗酶液酶活分别是野生型菌株粗酶液酶活的1. 73倍、1. 46倍、1. 37倍,突变菌株M1粗酶液酶活最高可达35. 4 U/L。     

铋-钨酸盐-罗丹明6G体系光度法测定痕量铋的研究

Bi(III)与钨酸盐及罗丹明6G在硫酸介质中反应生成离子缔合物,该离子缔合物在550 nm处有较强吸收,基于此现象,建立了一个测定痕量Bi(III)的光度分析方法。该方法的线性范围为0.2~1.0μg/L,摩尔吸光系数为7.27×107L·mol-1·cm-1,检出限(以3倍空白值的标准偏差除工作曲线的斜率计算)为0.035μg/L,而且常见离子基本上不干扰测定。将该方法用于自来水及环境水样中铋的测定,测定结果的相对标准偏差小于3.0%,加标回收率位于95~105%之间。     

本体Claisen转位合成二烯丙基双酚A

双酚A二烯丙醚通过本体Claisen转位反应合成具有四官能团的二烯丙基双酚A,确定了该本体Claisen转位反应为零级反应,在190℃和200℃下反应速率常数分别为3.50×10-4(L·mol-1)-1·s-1,3.80×10-4(L·mol-1)-1·s-1,190℃和200℃下理论反应时间分别为156 min和144 min.反应活化能和反应频率因子分别是1.46×104 J/mol和7.82×10-6.该反应为放热反应,且转位反应过程热释放量大于36 J/g,最佳反应温度区间为180～210℃.     

定点突变提高细胞色素P450 BM-3吲哚羟基化能力

为进一步提高细胞色素P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q)对吲哚的羟基化能力,根据酶结构与功能的关系,以突变酶E435T为基础,在168位点引入D168L突变,获得了吲哚羟基化能力得到显著提高的突变酶D168L/E435T。突变酶对吲哚的K_m为1.72 mmol·L^-1(父本2.09 mmol·L^-1),转化数(k_cat)为28.15 min^-1(父本4.04 min^-1),表明D168L定点突变可以略微提高酶对底物的亲和力,但主要的效应是促进了底物的转化速率,这两个效应的综合表现是使酶的催化效率(k_cat K_m^-1)比父本酶提高了8.48倍。此外,产物中副产物靛玉红的比例也降低为1.2%(父本7.3%),这说明该突变酶催化吲哚的区域选择性上也更有利于靛蓝的生成。     

氯磺酚N-蛋白质-TX-100体系的吸收光谱及其分析应用

在pH 3.09～4.16的Britton-Robinson缓冲介质中,有机试剂氯磺酚N能与生物大分子蛋白质形成紫红色复合物,λmax=620 nm,比试剂本身红移75 nm,摩尔吸光系数2.01×105 L·mol-1·cm-1,蛋白质在0～140μg·mL-1范围内遵循比尔定律,Tritton X-100存在反应灵...     

对二甲胺基亚苄罗丹宁与人血清白蛋白的显色反应研究

在pH8.0的磷酸盐缓冲溶液中,对二甲胺基亚苄罗丹宁(pDBR)与人血清白蛋白(HSA)形成橙红色复合物,λmax在480nm左右,ε为9.8×104L·mol-1·cm-1。蛋白质浓度在7.5～143mg/L范围内服从Beer′s定律。所提出的方法可直接用于测定血清中蛋白质的含量。     

高酶活性β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖

为了提高β-甘露聚糖酶的活性,本研究采用易错PCR将来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)KD-1的β-甘露聚糖酶基因manBl进行分子进化,并在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)中进行表达,以定向筛选酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体。筛选得到的突变体ManBl (I91N/L211I),其比酶活性为 15554.7 U/mg,是野生型ManBl的4.2倍,食品级表达的胞外酶产量达17601.3 U/mL。应用AlphaFold2对该酶的三维结构进行预测,结果表明,尽管β-甘露聚糖酶的2个位点(I91N 和 L211I)位于催化中心之外,但在很大程度上影响酶活性。β-甘露聚糖酶ManBl (I91N/L211I)水解魔芋胶产物主要由甘露六糖、甘露三糖和甘露二糖组成。该研究首次报道I91N/L211I 2个位点联合突变能够提高β-甘露聚糖酶活性；ManBl (I91N/L211I)食品级表达,为该酶绿色安全地应用奠定了基础。