乙肝病毒前S1基因与截短C基因穿梭表达载体构建

目的构建HBV前S1基因和截短C基因分泌型大肠杆菌和分枝杆菌穿梭质粒。方法以含HBV基因组质粒pCP10序列为模板,PCR扩增前S1基因和C基因截短片段,依次克隆至分泌型穿梭表达载体pDE22,电穿孔转化法将重组质粒导入耻垢分枝杆菌,经潮霉素抗性筛选及PCR鉴定,阳性克隆热休克诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析。结果扩增到了预期长度的2个目的基因,构建了分泌型穿梭载体,SDS-PAGE分析可见相对分子质量约23000蛋白表达条带。结论已成功构建耻垢分枝杆菌分泌表达前S1基因和截短C基因的穿梭载体,为研究含前S基因和截短C基因的重组BCG疫苗奠定了基础。     

采用卡介苗结核蜡酸合酶启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒

目的采用卡介苗(BCG)结核蜡酸合酶(Mycocerosic acid synthase,Mas)启动子,将分枝杆菌穿梭质粒pJEM11改建为分枝杆菌穿梭表达质粒。方法 PCR扩增BCG基因组中Mas启动子,定向克隆至质粒pJEM11的ApaⅠ与SnaBⅠ位点之间,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJMas。将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)UreB基因克隆至pJMas质粒,转化耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M.smegmatis)mc2155,SDS-PAGE检测重组UreB蛋白在M.smegmatis mc2155中的表达,Western blot分析其反应原性。结果克隆的Mas启动子序列与结核杆菌H37Rv株的Mas启动子序列(gi31619628)同源性达99%;重组穿梭表达质粒pJMas经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;UreB基因在M.smegmatis mc2155中成功表达,表达的蛋白可与Hp阳性病人血清发生特异性反应。结论成功构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJMas,为构建以耻垢分枝杆菌为载体的多价疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的基因克隆与表达

目的　克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白基因napA ,为研究幽门螺杆菌致病机理提供材料。方法　用PCR从幽门螺杆菌DNA中扩增出目的基因napA ,定向插入原核表达载体pQE30中 ,测序分析确认后 ,转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达 ,表达蛋白以NI2 + NTA柱进行纯化。结果　PCR扩增出 4 35bp目的基因片段napA ,克隆入pQE30质粒。工程菌诱导后SDS -PAGE显示新生表达蛋白带 ,相对分子质量为 170 0 0 ,与预期一致 ,约占菌体总蛋白的 38% ,经Ni2 + NTA柱纯化后可获得纯度为 95 5 %重组蛋白。Westernblot显示重组蛋白具有良好的抗原性。结论　克隆napA基因成功 ,并在大肠杆菌DH5α中高效表达。     

结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E(RpfE)的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因,双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a(+)载体连接,转化大肠杆菌Top10。阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达RpfE蛋白,并对表达蛋白进行鉴定和纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。经Ni2+-NTA金属螯合层析后,重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a(+)-RpfEv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

重组IL-17A耻垢分枝杆菌的构建及其对巨噬细胞表达炎症因子的影响

目的构建携带小鼠IL-17a编码基因的重组耻垢分枝杆菌(Recombinant Mycobacterium smegmatis,rMs),并研究其对巨噬细胞表达炎症因子的影响。方法双酶切质粒pET28a/mIL-17a和pMFA41,转化感受态E.coli TOP10,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMFA41/mIL-17a,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。分别以MOI为10∶1加入rMs、rMs+anti-IL-17A、Ms感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,并设PBS对照组。荧光定量PCR法检测转染细胞中β防御素-2(Defensinβ2,Defb-2)、巨噬细胞炎症蛋白(Macrophage inflammatory protein,MIP)-1α和MIP-2β基因mRNA水平;ELISA法检测细胞培养上清中MIP-1α、MIP-2β、IL-4及IFNγ蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pMFA41/mIL-17a经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白mIL-17A可与大鼠抗小鼠IL-17A单克隆抗体特异性结合,在相对分子质量约20 000处可见特异性反应条带;rMs组RAW264.7细胞中Defb-2、MIP-1α、MIP-2β基因mRNA水平较Ms组及PBS组明显升高(P<0.01);rMs组细胞培养上清中MIP-1α、MIP-2β、IL-4和IFNγ的蛋白浓度较Ms组及PBS组明显升高(P<0.01)。结论成功构建了表达具有生物学活性mIL-17A的重组耻垢分枝杆菌疫苗,该疫苗可有效促进体外培养的巨噬细胞表达MIP、Defb2、IFN-γ及IL-4,为新型疫苗的研发奠定基础。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与序列分析

目的:克隆并鉴定结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法:笔者首先获得了结核分枝杆菌基因组,利用PCR的方法得到288bp的ESAT-6基因。连接到克隆质粒载体pGEM-T中,以大肠杆菌JM109作为受体菌转化,通过筛选克隆并提取质粒,利用酶切鉴定、PCR鉴定、以及序列,来证明重组质粒pGEM-T-ESAT-6中含有结核分枝杆菌ESAT-6基因。结果:成功克隆了结核分枝杆菌ESAT-6蛋白基因。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因的克隆及其高效表达

目的克隆幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)基因,构建原核表达载体,并进行高效表达。方法以幽门螺杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UreB基因,双酶切后,与质粒pET-22b(+)连接,构建表达载体pET-22b(+)/UreB,分别转化E.coliBL21(DE3)、Origam(iDE3)和Rossetta(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经酶切及测序,证明幽门螺杆菌UreB基因的原核表达载体构建正确。3种重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,均可见相对分子质量为64000的目的蛋白条带,Rossetta(DE3)重组菌目的蛋白表达量最高,约占菌体蛋白的35%。Western blot结果表明,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了幽门螺杆菌UreB基因,并在大肠杆菌Rossetta(DE3)中获得了高效表达。     

幽门螺杆菌hp1188基因的克隆及高效表达

目的克隆并表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp1188基因,为研究幽门螺杆菌的黏附机制奠定基础。方法用PCR法从H.pylori标准株NCTC11637基因组DNA中扩增hp1188基因,克隆入原核表达载体pQE-30,构建重组原核表达质粒pQE30-hp1188,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达形式和表达量。表达蛋白经Ni2+-NTA树脂纯化,Western blot鉴定其反应原性。结果所构建的重组表达质粒pQE30-hp1188序列完整,插入的基因片段全长810bp,与GenBank中的hp1188基因同源性达98%。表达的重组蛋白相对分子质量约为30600,以1.0mmol/L IPTG诱导4h,表达量最高,破菌上清和沉淀中均有表达,可溶性蛋白表达量占全菌总蛋白的47%。重组蛋白纯化后纯度可达90%,并可被H.pylori患者血清识别。结论已成功克隆了H.pylori hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达。     

幽门螺杆菌尿素酶表位疫苗的构建、表达及鉴定

目的构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(Uepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白表位疫苗,并对其生物学及免疫学特性进行鉴定。方法设计引物,采用PCR法分别扩增UreB表位多肽编码基因Uepi和LTB编码基因,重叠延伸PCR法将两段基因拼接,T-A克隆后,构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB,经酶切鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出206bp和336bp的目的片段,重叠延伸PCR扩增出524bp的融合目的基因片段。原核表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB经酶切及测序鉴定,与设计序列一致。重组工程菌pET-22b(+)-Uepi-LTB/BL21经IPTG诱导,目的蛋白表达率约25%,SDS-PAGE分析相对分子质量约20000,目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达96%,Westernblot鉴定该融合蛋白与兔抗LTB多抗血清可发生特异性结合。结论HpUreB表位串联体与LTB融合蛋白的表位疫苗经基因克隆,可获得高效表达,并显示出较好的免疫活性,为新一代Hp疫苗的研制奠定基础。     

人HSP70与MAGE-4表位基因原核表达载体的构建及表达

目的构建热休克蛋白70(HSP70)与黑色素瘤抗原-4(MAGE-4)抗原表位基因的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法在热应激条件下,用PCR法从结肠腺癌细胞获取HSP70基因。在线用蛋白质二级结构预测软件分析MAGE-4抗原表位,PCR获取MAGE-4抗原特征表位基因。将二者分别克隆入pGEM-Teasy载体,酶切鉴定后,将HSP70基因亚克隆入pET28a原核表达载体,再将MAGE-4基因克隆入HSP70基因的下游,构建重组质粒pET28a-HSP70-MAGE-4。转化大肠杆菌,IPTG诱导表达并鉴定。结果所构建的HSP70与MAGE-4抗原表位基因表达载体pET28a-HSP70-MAGE-4,经PCR及DNA测序结果表明构建正确。SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带。结论已成功构建了人HSP70与MAGE-4抗原表位基因的原核表达载体,为疫苗研究提供了依据。     

重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析。方法通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定。结果成功扩增到904bp的目的基因。重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%。Western blot分析表明目的蛋白具有较好的反应原性。ELISA试验证实目的蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应。结论已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础。     

Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的重组表达Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白(Surfaceimmunogenicprotein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白。方法用PCR的方法从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入pMD18T载体,构建原核表达载体pET32aSIP,用BL21(DE3)/pET系统表达TrixSIP融合蛋白,SDSPAGE和质谱分析鉴定表达产物,并对表达蛋白进行初步纯化。结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中Ⅰa/c型GBS的SIP的基因序列同源性为99%。SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET32aSIP总蛋白中出现一条相对分子质量为66000的新蛋白带。质谱分析和蛋白质库的比较证实其为B族链球菌表面免疫相关蛋白(SIP)的可能性分数为74。结论已成功表达并初步纯化SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。     

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1基因的原核表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1(ATP-dependent Clp proteolytic subunit 1,ClpP1)基因重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中PCR扩增ClpP1基因,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,转化大肠埃希菌B21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约35 000,可与鼠抗His单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpP1蛋白在MTB中的生物学特性奠定了基础。     

金黄葡萄球菌ClfA活性基因的克隆及原核表达

目的克隆金黄葡萄球菌表面蛋白凝集因子A(ClfA)活性基因,并进行原核表达。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ClfA(221-550)活性基因,克隆入载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-ClfA(221-550),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增出987bp的目的基因片段,重组表达质粒经双酶切证明构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约36000处可见目的条带,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的36.76%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了金黄葡萄球菌ClfA活性基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了目的蛋白。     

HIV-1 HXB2株Tat核心碱性区多肽Tat_(38-61)的原核表达及其免疫反应性

目的 构建HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法采用PCR法从HIV-1 HXB2株Tat1-101基因中扩增编码Tat38-61的基因序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后,ELISA法鉴定其免疫反应性。结果重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量约21 300处可见目的 蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的67.4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达97%以上;ELISA结果显示,该融合蛋白与兔抗PEPTIDE-Tat1-101血清及HIV阳性血清均呈特异性反应。结论已成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61的重组原核表达质粒,表达并纯化了PET32a(+)-Tat38-61融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为Tat38-61噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。