人心肌脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备人心肌脂肪酸结合蛋白(H-FAB)单克隆抗体。方法利用重组H-FABP蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)在PEG的作用下进行融合,通过杂交瘤细胞的筛选,细胞的亚克隆以及扩大培养建立分泌抗H-FABP特异性抗体的单克隆细胞株。将细胞接种入小鼠体内制备腹水抗体,纯化后得到抗H-FABP单克隆抗体并对其性质进行鉴定分析。得到3株稳定分泌H-FAB抗体的单克隆细胞株,命名为2C06、2F08、6G03,非竞争性ELISA测定亲和力常数得知三株抗体的亲和力常数都达到108以上,三株抗体的亲和力较好。交叉实验表明三株单克隆抗体与牛血清、猪血清、鼠血清均无交叉反应,western blot实验证明对H-FABP有较好的特异性。成功得到3株特异性识别H-FAB单克隆细胞株,可用于H-FAB的检测研究。     

鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。     

体外培养杂交瘤细胞生产人用鼠源单克隆抗体

<正>目前,人用鼠源单抗的生产方法一般分为体内法和体外法2种。体内法即腹水法。尽管腹水中抗体浓度比较高（2～10mg/ml）,但由于所用的BALB/c小鼠必须达到SPF级,繁殖、饲养BALB/c小鼠及生产腹水、纯化抗体的厂房必须符合GMP要求,WHO及我国对体内法生产的人用鼠源单克隆抗体的质检项目繁多,要求严格,因此限制了体内法在人用鼠源单抗生产领域的应用。由于体外法（杂交瘤细胞体外培养法）的产品纯度高,可以避免鼠类病毒的污染,简化质检项目,操作具有可控制性,适用于大规模工业生产,     

牛心肌肌钙蛋白T的提取、纯化及其单克隆抗体的制备

目的提取、纯化牛心肌肌钙蛋白T(Cardiac troponin T,cTnT),并制备其单克隆抗体。方法采用组织匀浆、蛋白层析技术提取、纯化牛cTnT,紫外分光光度法检测其浓度;SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA法检测其反应特性。将纯化的牛cTnT免疫小鼠,进行细胞融合,间接ELSIA法筛选阳性杂交瘤细胞株,采用小鼠体内法制备腹水。结果纯化的两批牛cTnT浓度分别为0.246和0.336 mg/ml;相对分子质量约为37 000,纯度分别为86.02%和93.77%;纯化的cTnT蛋白可与鼠抗牛cT-nT单克隆抗体结合。共获得5株分泌抗牛cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中,阳性杂交瘤细胞株3B10腹水抗体效价达1∶10 240。结论已成功提取、纯化了牛cTnT,并建立了稳定分泌抗牛cTnT单抗的杂交瘤细胞株,为cTnT检测试剂盒的国产化奠定了基础。     

NIH小鼠在单克隆抗体制备中的应用

自从杂交瘤技术建立以来,McAb的制备技术得到很大的发展,McAb的需要量也日以增多,但由于制备单抗腹水所用的BALB/c小鼠,饲养条件要求较高,腹水产量较低等问题,致使McAb的价格昂贵,给临床应用带来困难。为此,本实验采用NIH鼠代替BALB/c鼠制备单克隆抗体腹水,并与BALB/c小鼠进行比较。结果表明:NIH小鼠组内个体间差异较大,单只的腹水产量较多,能够采集腹水的时间较长,所以总产量明显高于BALB/c小鼠,为BALB/c小鼠的2.4倍;而BALB/c小鼠虽然组内的个体差异小,产腹水率高,但单只腹水产量少,而且耐受力差且较快出现死亡,故腹水产量…     

抗氧化低密度脂蛋白单克隆抗体制备方法的研究

目的研究抗氧化低密度脂蛋白(OxLDL)单克隆抗体的制备方法。方法采用小鼠体内法制备抗OxLDL单克隆抗体时,腹水中抗体经SuperoseTM6 HR10/30凝胶柱进行一步纯化;采用细胞培养法时,分别对杂交瘤细胞生长特性和抗体表达条件进行研究,细胞培养上清中抗体经Streamline SPXL阳离子扩张柱床层析和QXL阴离子交换层析纯化。结果小鼠体内法制备的抗体纯度为95.7%,回收率为65.4%;细胞培养上清中得到的抗体纯度为94.7%,回收率为47.8%。结论已建立了2种抗OxLDL单克隆抗体的制备方法,为OxLDL酶联免疫检测试剂盒的研制奠定了基础。     

人生长激素抗独特型抗体的制备及免疫学鉴定

目的制备人生长激素抗独特型抗体,并进行鉴定。方法应用人生长激素抗原(Ag)纯品,通过杂交瘤技术制备人生长激素单克隆抗体(Ab1),经免疫亲和层析柱纯化后,免疫家兔,其血清经饱和硫酸铵纯化后,获得人生长激素抗独特型抗体(Ab2)。再应用ELISA法进行鉴定。结果Ab2与Ab1呈阳性反应,与BALB/c小鼠γ球蛋白呈阴性反应。Ab2与Ag竞争结合Ab1,Ab2抑制Ab1与Ag的结合。结论已成功制备针对人生长激素的单克隆抗体和具有人生长激素抗原内影像的抗独特型抗体。     

高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体细胞株的建立及其表达产物的分析

目的建立高表达抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体的工程细胞株。方法将构建的抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体基因真核表达载体转染CHO细胞,并采用DHFR/MTX基因扩增策略,经反复加压和克隆筛选,提高抗体的表达量。用ELISA、Westernblot和体外中和试验分析比较抗人TNF-α人-鼠嵌合抗体与鼠亲本单抗的特性。结果获得的表达抗人TNF-α嵌合抗体的转染细胞系2F5,在静止培养4d后工程抗体的表达量约80mg/L。所表达的工程抗体优于鼠亲本单抗F7/2,并具有良好的特异性和中和活性,其相对亲和力约为2.1×10-10mol/L。结论已成功建立了高表达的嵌合抗体工程细胞株,其抗体具有潜在的临床应用前景。     

应用3种品系小鼠评价新型抗胃泌素疫苗体液免疫原性

目的应用3种品系小鼠评价新型抗胃泌素疫苗的体液免疫原性,为该疫苗生物活性检测方法的建立提供参考。方法将疫苗(500μg/m L)肌肉注射免疫3种不同品系(BALB/c、NIH、C57BL/6)小鼠,0.1 m L/只,阴性对照给予等体积疫苗佐剂,每2周免疫1次,共免疫3次,分别于首次免疫后第2、4、6、8周经眼眶采血,分离血清,ELISA法检测血清特异性抗胃泌素Ig G抗体滴度。结果首次免疫后第2周,50%NIH小鼠血清可检测到抗体滴度,第4、6周,100%NIH小鼠血清可检测到抗体滴度,第8周67%NIH小鼠血清可检测到抗体滴度,第6、8周与其第4周抗体滴度差异无统计学意义(P0.05);第4、6、8周,100%BALB/c和C57BL/6小鼠血清均可检测到抗体滴度,第6、8周分别与其第4周抗体滴度相比,差异均无统计学意义(P0.05)。首次免疫后第4周,NIH小鼠血清抗体滴度均显著高于BALB/c和C57BL/6小鼠(P0.05),分别较其高356%和465%;首次免疫后第6周,NIH小鼠血清抗体滴度均显著高于BALB/c和C57BL/6小鼠(P0.05),分别较其高506%和413%。结论 NIH小鼠对该疫苗的体液免疫反应活性较BALB/c、C57BL/6小鼠更敏感,可用NIH小鼠评价该疫苗的体液免疫原性。     

玉米赤霉烯酮抗独特型单抗的制备及特异性分析

目的制备并鉴定玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)抗独特型单抗Ab2β-1D5。方法将ZEN单抗1G4与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合后,以ZEN单抗Fab片段作为包被抗原,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,制备腹水型单抗,并经Protein G亲和层析柱进行纯化。间接ELISA法检测ZEN抗独特型单抗的抗体效价及特异性;间接竞争ELISA法检测ZEN抗独特型单抗类型、灵敏度及其与ZEN毒素间的相关性。结果共获得6株稳定分泌ZEN抗独特型单抗的杂交瘤细胞株,腹水型抗体效价为1∶1.2×105～1∶2.0×105;6株单抗均为β型抗独特型抗体(Ab2β),其中Ab2β-1D5抗体灵敏度最高,对ZEN的IC50值达10.09 ng/ml,其与ZEN毒素呈线性相关(r=0.990);ZEN抗独特型单抗与莱克多巴胺、重金属铅、铬及虾过敏原单抗均无交叉反应,特异性良好。结论已成功制备玉米赤霉烯酮抗独特型单抗,该抗体与ZEN间存在"内影像"关系,可以替代ZEN毒素标准品,用于建立ZEN的无毒免疫学检测技术。     

牛血清白蛋白单克隆抗体的筛选与双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的筛选高效抗牛血清白蛋白(BSA)单克隆抗体细胞株,并建立BSA抗原检测的双抗体夹心ELISA法。方法分别采用辛酸-硫酸铵法和葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化单抗,并进行抗体类型、腹水效价、特异性和相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立BSA双抗体夹心ELISA检测法,并进行初步应用。结果筛选出4株可稳定分泌抗BSA单抗的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG,抗体滴度均可达10-6,特异性良好,相对亲和力较高。建立的双抗体夹心ELISA法线性范围为1.25～20ng/ml,R2>0.98,灵敏度为1.25ng/ml。结论已筛选出高效抗BSA的单抗,并建立了BSA双抗体夹心ELISA检测方法。     

镉离子单克隆抗体的制备及其阻断ELISA检测方法的建立

目的制备重金属镉离子(Cd2+)单克隆抗体,并建立Cd2+残留阻断ELISA检测方法。方法用异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸(ITCBE)螯合Cd2+合成Cd-ITCBE半抗原,异硫氰酯法制备免疫抗原Cd-ITCBE-BSA和检测抗原Cd-ITCBE-OVA,并进行鉴定;用Cd-ITCBE-BSA免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后,间接ELISA和阻断ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备Cd2+单抗,并进行鉴定;建立检测Cd2+残留的阻断ELISA法,并进行验证。结果 Cd-ITCBE-BSA和Cd-ITCBE-OVA中BSA与OVA含量分别为7.1和6.7 mg/ml,Cd2+含量分别为191.7和130.1μg/ml;共筛选出1A3、2B7、2E10、4F3 4株杂交瘤细胞,其中2E10株分泌的Cd2+单抗效价最高,细胞培养上清和腹水的间接ELISA效价分别达1∶4.32×102和1∶5.12×105,亲和常数(K)a也最高,为7.58×108 L/mol,对Cd2+的半数抑制浓度(IC50)为16.3μg/L;建立的阻断ELISA法的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合;最低检测限为5μg/L;饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为92.9%和88%,平均变异系数分别为12.35%和12.45%;与Hg2+的交叉反应率为96.5%,与其他化合物未见交叉反应;试剂可在4℃保存180 d。结论已成功制备了高亲和力的Cd2+单抗,并建立了快速、简便、敏感、特异的Cd2+残留阻断ELISA检测方法。     

无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法的建立及适用性的初步验证

目的建立无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法(PSPT),并对其适用性进行初步验证。方法采用纯化的百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)包被酶标板,以羊抗鼠IgG酶标抗体为指示抗体,建立检测小鼠抗PT抗体和抗FHA抗体的间接ELISA法,并对该方法进行初步验证。在此基础上建立PSPT法,并与MICA法进行相关性分析。结果建立了小鼠抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA,标准曲线线性范围内R≥0.99;经验证,两系统与无关抗体之间均无交叉反应;检测限度分别为93.7500和59.0625mEU/ml,检测限量分别为100和70mEU/ml。将10批无细胞百日咳原液分别以PSPT法和MICA法进行效价测定,两者呈正相关,两种方法检测结果差异无统计学意义,且PSPT法比MICA法重复性更好。结论抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA灵敏度高,准确性及精密性均较好,在此基础上建立起来的PSPT法有望替代MICA法,用于检测无细胞百日咳疫苗的效价。     

抗3种β-激动剂双特异性单克隆抗体的建立及鉴定

制备抗克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺双特异性抗体并初步鉴定。将分泌抗克仑特罗、沙丁胺醇抗体的细胞株和分泌抗莱克多巴胺抗体的细胞株分别驯化,使之成为HAT敏感株。将两者融合,筛选分泌双特异性单克隆抗体的杂交-杂交瘤株,然后对其进行初步鉴定。共获得5株杂交-杂交瘤细胞株,将其分泌的双特异性单克隆抗体(BsAb)经过酶联免疫吸附法(ELISA)初步检测,IC50可达1 ng/mL,腹水效价为105以上,用ELISA法证明BsAb只与克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺有特异性反应。该方法制备简单、风险低、灵敏度高、周期短,具有较好的应用前景。     

泰乐菌素单克隆抗体的制备及竞争ELISA检测方法的建立

目的制备泰乐菌素(Tylosin)单克隆抗体,并建立泰乐菌素竞争ELISA检测方法。方法用羰基二咪唑将半抗原泰乐菌素分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备泰乐菌素免疫抗原Tylosin-BSA和检测抗原Tylosin-OVA,用紫外光谱扫描检测Tylosin-BSA偶联物,辣根过氧化物酶标记Tylosin-OVA偶联物。采用杂交瘤技术,制备特异性抗泰乐菌素单克隆抗体,建立泰乐菌素竞争ELISA检测方法。结果筛选出2株稳定分泌抗泰乐菌素单抗的杂交瘤细胞株3E4和2G10,2G10分泌的单抗腹水效价为6×10-4,抗体类型为IgG1型,轻链为κ链,在酸、碱及热条件下均较稳定。选择该单抗建立了泰乐菌素竞争ELISA检测方法。该方法灵敏度达50ng/ml,标准曲线线性关系良好(r=0.9827),且特异性、稳定性较好,准确性、精密性较高。结论已成功制备了泰乐菌素单克隆抗体,并建立了竞争ELISA检测方法,可用于动物源性食品中残留泰乐菌素含量的检测。     

α1-酸性糖蛋白单克隆抗体的制备及检测方法的建立

目的制备α1-酸性糖蛋白(α1-Acid glycoprotein,α1-AGP)单克隆抗体(McAb),建立α1-AGP的ELISA检测方法,用于检测人体血液、尿液及各种组织液中α1-AGP的水平。方法用高氯酸沉淀人血清中α1-AGP,经离子交换层析和高压液相层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,建立特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备并鉴定McAbs,分析各株分泌抗体的效价、特异性、位阻群、类及亚类。制备针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA检测试剂盒,分析其稳定性、灵敏度和特异性,并进行临床评价。结果建立了9株特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,所有抗体的轻链均为κ链。根据位阻分析结果,将9个细胞株分泌的抗体分为5个位阻群,腹水效价在1×10-4~1×10-7之间,且均有较好特异性。制备的α1-AGP双抗体夹心ELISA试剂盒灵敏度达2ng/ml,且检测结果与α1-AGP含量呈现良好的线性关系(r=0.9916),并与其他血清蛋白无交叉反应,试剂盒置37℃放置3d及4℃放置2个月,稳定性良好。用该试剂盒检测96份正常人血样,其α1-AGP平均值为0.43~1.32mg/ml;105份Ⅱ型糖尿病患者血样,其平均值为0.88~2.35mg/ml,经统计学分析,两者差异有显著意义。结论已成功制备出α1-AGP McAb,并建立了针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA,制备的试剂盒可用于临床检测。     

抗黄曲霉毒素B1重链IgG2b亚型单克隆抗体的制备及应用

目的制备抗黄曲霉毒素B1(AFB1)的重链IgG2b亚型单克隆抗体,并建立黄曲霉毒素B1的间接竞争ELISA检测方法。方法采用AFB1-BSA偶联物为免疫抗原,AFB1-STI偶联物为检测抗原,利用间接竞争ELISA筛选分泌抗AFB1单抗的细胞株,并对抗体进行鉴定。结果筛选到1株能分泌特异性抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其染色体数目为(90±10)条;所分泌的单抗亚类重链为IgG2b,轻链为λ;间接ELISA检测该株杂交瘤细胞分泌上清效价在1∶12800～1∶25600,纯化腹水效价为1∶105～1∶106。传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;建立的间接竞争ELISA检测方法的最低检出限为0.001ng/ml,校正曲线的线性范围为0.005～5ng/ml,IC50为0.01ng/ml;与AFB1的结构类似物AFM1和化学结构有差异的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的交叉反应率分别为1.4%和<1%。结论所制备的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体具有高度特异性和稳定性,可应用于间接竞争ELISA检测方法。