幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因的克隆及其高效表达

目的克隆幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)基因,构建原核表达载体,并进行高效表达。方法以幽门螺杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UreB基因,双酶切后,与质粒pET-22b(+)连接,构建表达载体pET-22b(+)/UreB,分别转化E.coliBL21(DE3)、Origam(iDE3)和Rossetta(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经酶切及测序,证明幽门螺杆菌UreB基因的原核表达载体构建正确。3种重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,均可见相对分子质量为64000的目的蛋白条带,Rossetta(DE3)重组菌目的蛋白表达量最高,约占菌体蛋白的35%。Western blot结果表明,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了幽门螺杆菌UreB基因,并在大肠杆菌Rossetta(DE3)中获得了高效表达。     

人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达及鉴定

目的构建人巨细胞病毒(HCMV)pp65基因片段(363～505位氨基酸)的原核表达质粒,并鉴定所表达蛋白的反应原性。方法以含有HCMVpp65全长基因的pGEM-T-pp65质粒为模板,PCR扩增pp65基因第1087～1515位核苷酸片段,酶切后插入pET-21a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,纯化后进行Western blot鉴定。结果酶切分析和测序证明原核表达质粒pET-21a(+)-pp65构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,以1.0mmol/L IPTG诱导5h,目的蛋白的表达量最高。纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功构建了HCMV pp65基因片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白。     

乙型肝炎病毒P蛋白在大肠杆菌中的分段表达及纯化

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化。方法PCR扩增HBVP基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526bp),分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析。用Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Westernblot分析。结果重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%。经Ni2+-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了HBVP基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBVP蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础。     

人类博卡病毒结构蛋白基因VP2的克隆与表达

采用PCR方法扩增出人类博卡病毒结构蛋白基因VP2,通过双酶切、连接、转化等方法将VP2基因克隆到原核表达载体pMAL-c2x上,构建重组质粒pMAL-c2x-VP2,通过双酶切检测重组质粒构建成功;用0.8 mmol.L-1IPTG诱导融合蛋白表达,经SDS-PAGE检测、Western Blot分析,证明目的蛋白得到了表达。可为目的蛋白的纯化及结构和功能的研究、相应抗体的制备打下坚实的基础。     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

人BimS蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人BimS基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人BimS基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到327bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-BimS经双酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约37000,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度可达93%。结论已成功克隆并原核表达了人BimS基因,得到纯度较高的BimS蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体的构建

目的构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白。方法合成人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位的串联基因,克隆入pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-28a-H3,经酶切鉴定和DNA序列分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行ELISA和Westernblot鉴定。结果重组载体pET-28a-H3酶切片段大小和DNA序列分析与预期结果一致。表达的目的蛋白相对分子质量约9400,与相应的多克隆抗体反应性良好。结论已成功构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体pET-28a-H3,并表达了目的蛋白,为制备单克隆和多克隆抗体奠定了基础。     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。     

重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析。方法通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定。结果成功扩增到904bp的目的基因。重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%。Western blot分析表明目的蛋白具有较好的反应原性。ELISA试验证实目的蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应。结论已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础。     

人Bid蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人Bid基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人Bid基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到588bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid经双酶切鉴定和测序表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约48000,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度可达97%。结论已成功克隆并原核表达了人Bid基因,得到纯度较高的Bid蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的原核表达与抗原性分析

目的表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒株VP2蛋白并检测其抗原活性。方法以IBDV强毒致弱株Gt株基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法扩增VP2基因,并将其克隆入pUC18载体,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET30a中,并经酶切、PCR、测序鉴定,阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)菌,经IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE及Westernblot检测。结果阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)后,经诱导表达了目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的15%。Westernblot检测表达蛋白可与IBDV阳性血清发生反应,而与阴性对照血清不发生反应。结论已成功表达了鸡传染性法氏囊病毒弱毒株VP2蛋白,且具有良好的抗原性。     

HBV PreS2-MBP融合蛋白质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌pMALP2x系统中表达HBVPreS2MBP融合蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2蛋白基因克隆至原核表达载体pMALP2x中,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。表达产物经SDSPAGE和Westernblot检测,并经阴离子交换层析、AmyloseResin亲和层析纯化。结果成功构建了重组载体pMALP2x/S2,诱导蛋白为MBP标记的可溶性的PreS2MBP融合蛋白,具有良好的抗原性,可经AmyloseResin亲和层析纯化。结论pMALP2x系统可成功表达PreS2MBP融合蛋白。     

人HSP70与MAGE-4表位基因原核表达载体的构建及表达

目的构建热休克蛋白70(HSP70)与黑色素瘤抗原-4(MAGE-4)抗原表位基因的原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法在热应激条件下,用PCR法从结肠腺癌细胞获取HSP70基因。在线用蛋白质二级结构预测软件分析MAGE-4抗原表位,PCR获取MAGE-4抗原特征表位基因。将二者分别克隆入pGEM-Teasy载体,酶切鉴定后,将HSP70基因亚克隆入pET28a原核表达载体,再将MAGE-4基因克隆入HSP70基因的下游,构建重组质粒pET28a-HSP70-MAGE-4。转化大肠杆菌,IPTG诱导表达并鉴定。结果所构建的HSP70与MAGE-4抗原表位基因表达载体pET28a-HSP70-MAGE-4,经PCR及DNA测序结果表明构建正确。SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带。结论已成功构建了人HSP70与MAGE-4抗原表位基因的原核表达载体,为疫苗研究提供了依据。     

HIV-1C亚型调控蛋白Nef在大肠杆菌中的表达

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型调控蛋白Nef,为研制HIV疫苗寻找新的途径。方法通过PCR扩增,获得HIV-1C亚型Nef基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。结果表达产物是相对分子质量为50000的GST融合蛋白,且能与p27单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Nef蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达。     

结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E(RpfE)的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因,双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a(+)载体连接,转化大肠杆菌Top10。阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达RpfE蛋白,并对表达蛋白进行鉴定和纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。经Ni2+-NTA金属螯合层析后,重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a(+)-RpfEv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

人T淋巴细胞CD3ε链的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人T淋巴细胞CD3ε(hCD3ε)链。方法以健康成人外周血单个核细胞总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增人CD3ε链基因,并克隆入pCR-II载体,酶切鉴定及测序分析后,再定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-hCD3ε,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果酶切分析及DNA测序证实,hCD3ε链基因被正确克隆入pGEX-4T-3载体,并能在原核系统中稳定表达。表达产物的相对分子质量为49 500,0.2 mmol/L IPTG 25℃诱导表达4.5 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的29.3%,其中可溶性表达占12.8%。纯化的融合蛋白纯度可达86.1%,可分别被兔抗人CD3ε多抗和羊抗GST多抗识别。结论已成功地原核表达并纯化了GST-hCD3ε融合蛋白。     

抗菌肽Dermaseptin S4及其突变体基因在大肠杆菌中的表达

目的构建表达抗菌肽Dermaseptin S4(DS4)及其突变体K4-S4的工程菌,并表达目的蛋白。方法采用重叠延伸PCR法设计和扩增抗菌肽DS4及K4-S4基因,定向克隆入载体pUC-18中,经酶切、测序鉴定,重组至表达载体pGEX-4T-1中,构建抗菌肽DS4及K4-S4基因表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE鉴定。结果构建的抗菌肽DS4及K4-S4基因工程菌所表达的目的蛋白,经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量34 000的特异性目的条带,37℃诱导5 h的蛋白表达量最高,且多数以包涵体形式存在。结论已成功构建抗菌肽DS4及K4-S4工程菌,并表达目的蛋白,为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

LTB-MOMP融合基因表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建含大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)和鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)融合基因(LTB-MOMP)的表达载体,并在原核细胞中表达融合蛋白。方法应用PCR从质粒EWD299和鹦鹉热衣原体中扩增LTB和MOMP基因,经与柔性肽连接后,插入pET-28a载体中,酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达,并纯化目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot分析外源蛋白的表达及表达产物的抗原特异性。结果重组工程菌可以表达相对分子质量约为54000的LTB-MOMP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的42%,LTB-MOMP融合蛋白具有良好的抗原特异性。结论已成功构建了LTB-MOMP融合基因表达载体,并在原核细胞中获得表达。     

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达

目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌,并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段,连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌DH5,αIPTG诱导表达,经Western blot鉴定,Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708bp DNA片段,并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000,经Western blot鉴定,与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。