北京棒杆菌单体天冬氨酸激酶T379N/A380C/T65I/D173G突变体酶学性质表征及工程菌构建

选取天冬氨酸激酶抑制剂赖氨酸(Lys)的结合位点苏氨酸(Thr) 379和丙氨酸(Ala) 380、底物天冬氨酸(Asp)的结合位点Thr65、既是底物也是ATP结合位点的催化活性中心Asp 173,对4个关键残基位点进行定点饱和突变.采用高通量筛选方法成功构建突变体T379N/A380C/T65I/D 173G,与野...     

重组大肠杆菌全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸

4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E. coli BL21(DE3)中的异源表达。其次,通过同源建模和蛋白质结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成丙氨酸Ala的原则,对I156位点进行了定点突变,以增大底物结合口袋,扩宽底物通道进而提高4-HIL的产量。最后,对野生酶及突变酶的酶学性质、突变酶的羟基化反应体系进行研究,在最优催化条件下,分批补料转化底物进行4-HIL的生产。酶学性质结果显示,野生酶及突变酶I156A的最适温度均为25℃,最适pH均为7.0;突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍,L-ILe转化率提高了28%。羟基化反应体系的最优转化条件为:20 mmol/L L-ILe,20 mmol/L α-酮戊二酸,8 mmol/L Fe~(2+),30 mmol/L抗坏血酸和HEPES(50 mmol/L,pH 7.0)缓冲液。在最优转化条件下,重组菌E. coli BL21/pET28a-ido~(I156A)进行分批补料转化底物,时间间隔为4 h,32 h后得到77.3 mmol/L 4-HIL,底物最高转化率98.35%。     

定点突变提高Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶催化活性

通过分析超嗜热古菌Thermococcus siculi HJ21高温酸性α-淀粉酶基因,对6个可能提高酶催化活性的氨基酸残基进行定点突变,获得比未突变酶催化活性较高的突变子Y184H、Y121S、A109V、K98R、V125L。将以上5个突变位点集中在一个突变子上得到突变酶TSAM-23,该突变酶与未突变酶相比,酶的催化效率有较大提高,酶的活力和90℃条件下的热稳定性分别提高了3.75倍和2.4%,最适反应pH值为5.0,比未突变酶降低0.5,较之突变前有更好的工业应用价值。     

嗜热脂肪芽孢杆菌耐热β-半乳糖苷酶功能位点的累积进化研究

针对嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源耐热β-半乳糖苷酶Bga B底物结合位点构建突变体,研究底物结合位点累积突变的功能进化及水解活性的变化规律。实验结果表明:Y272A与E351R的累积突变体比酶活为野生型酶的3.67倍,为单点突变体Y272A的2倍;Y272A/E351R突变体的Km值增大,其对乳糖的亲和力下降,但由于Kcat值增大,使累积突变体Y272A/E351R催化效率提高为野生型酶催化效率的7.8倍。本研究结果表明底物结合位点间的累积突变可改变底物亲和性,并对水解催化活性进化起到正向促进作用。     

北京棒杆菌新型天冬氨酸激酶双突变株Y198N/D201M的构建及酶学性质表征

利用定点突变提高天冬氨酸族氨基酸合成途径中的首个关键别构酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)活力,并解除其受到代谢产物赖氨酸(Lys)与苏氨酸(Thr)的协同反馈抑制。在获得北京棒杆菌单体AK并分析结构的基础上,选取ATP周围的关键残基位点Tyr198和Asp201进行饱和定点突变,采用高通量筛选方法成功获得了酶活力提高到18.26倍的双突变体Y198N/D201M,动力学结果显示,K_m值由野生型(wild type,WT)的3.58 mmol/L减小到2.37 mmol/L,与底物亲和力增强;n值由WT的1.91减小到1.58,正协同性降低。酶学性质研究表明:双突变体Y198N/D201M最适反应温度由WT的25℃增至28℃,最适pH值由WT的8.0降至7.5,半衰期由WT的4.66 h延长至5.32 h。突变体Y198N/D201M较WT,在各个抑制剂浓度下活性抑制作用表现出不同程度的减弱,甚至在5 mmol/L和10 mmol/L Lys+Met、Thr+Met和Lys+Thr+Met条件下有激活作用。     

耐热普鲁兰酶CBM68结构域中关键位点对其酶学性质的影响

通过对Anoxybacillus sp.LM18-11来源的耐热普鲁兰酶(Pul A)与麦芽三糖共结晶的晶体结构分析,在新命名的底物结合域CBM68中预测出4个与底物结合有关的氨基酸位点(Y14、D16、K62和R96),分别将4个氨基酸位点突变为丙氨酸,得到突变体Pul A~(Y14A)、Pul A~(D16A)、Pul A~(K62A)和Pul A~(R96A)。其中,突变酶Pul A~(Y14A)和Pul A~(R96A)的底物结合力及催化效率与野生酶Pul A相比均有明显降低,其K_m值分别比Pul A提高了4.2倍和2.5倍,k_(cat)/K_m分别为Pul A的29%和37%。同时,Pul A~(Y14A)和Pul A~(R96A)的最适作用温度均降低了10℃,Pul A~(R96A)的最适作用p H也降低了0.5个单位。说明Y14和R96是CBM68结构域中的关键氨基酸位点,这两个位点的发现为进一步探究CBM68结构域的作用机制奠定了基础。     

北京棒杆菌天冬氨酸激酶五突变体的构建及酶学性质表征

目的:天冬氨酸激酶（aspartate kinase,AK）是催化天冬氨酸族氨基酸合成的第一个关键别构酶,为了提高其活力,并削弱或解除末端产物赖氨酸（Lys）与苏氨酸（Thr）对AK的协同反馈抑制。方法:在获得的北京棒杆菌四突变体T379N/A380C/G171I/Y198N AK（NCIN AK）的基础上,发现G295位点与抑制剂Thr通过氢键相连且高度保守, 对G295位点进行定点饱和突变,提取质粒,转入大肠杆菌BL21感受态细胞中诱导表达,采用高通量筛选获得酶活力显著提高的突变株,对野生型（Wild type,WT）、五突变体T379N/A380C/G171I/Y198N/G295L AK（NCINL AK）进行酶动力学研究和酶学性质表征。结果:成功构建五突变体NCINL AK,最大反应速率V_max为259 U/（mg·min）。与野生型相比,米氏常数K_m值由3.44 mmol/L减小到0.93 mmol/L,酶与底物结合更加紧密;希尔系数n值由2.73降为1.21,正协同性降低;最适反应温度由25 ℃提高到28 ℃,最适pH由8.0升至8.5,半衰期由4.7 h延长至5.2 h;五突变体NCINL AK较野生型WT AK,不同底物抑制剂浓度在0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L时,抑制作用被不同程度的减弱,甚至Lys抑制作用被完全解除,且在10 mmol/L Thr条件下有激活作用。结论:本实验获得酶活力提高87.20倍的五突变体NCINL AK,酶学性质得到明显改善,在一定抑制剂浓度范围内,基本解除Lys对AK的反馈抑制作用,Thr的反馈抑制得到一定缓解,提高了积累大量天冬氨酸族氨基酸的可能性,为构建高产天冬氨酸族氨基酸菌株提供参考,使甲硫氨酸（Met）等氨基酸的无污染、高效生产成为可能。     

金黄色葡萄球菌新型耐热核酸酶(Nuc2)的定点突变与特性分析

本研究选取了F60、A62、T102和Y135这4个可能的关键位点,采用定点突变的方法成功构建了5个Nuc2的单点和多点突变体。体外表达并纯化这些核酸酶,对其活性、耐热性和二级结构进行测定。结果表明:经方差分析(p0.05),T102M和F60A/A62L/T102M/Y135V的核酸酶活性与野生型相比较显著下降,并且F60A/A62L/T102M/Y135V的酶活性基本丧失;T102M和F60A/A62L的耐热性明显弱于野生型;T102M和F60V/A62L的二级结构中α-螺旋结构的含量明显低于野生型,F60A/A62L/T102M/Y135V的二级结构中包含有无规卷曲。因此,推断T102是维持Nuc2核酸酶活性、耐热性和二级结构稳定的一个关键位点;F60、A62、T102和Y135及其与邻近氨基酸之间的相互作用对维持Nuc2的性质稳定起着重要作用。     

大肠杆菌中顺式-3-羟脯氨酸羟化酶的定向改造

对以L-脯氨酸为底物,产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET21a-ptrp2-H3P出发,通过易错PCR随机突变和定点突变处理,利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法筛选出2株H3P高产菌P-2-H3、P-9-D5。经基因测序后得到5个突变位点R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I,并在出发菌基础上对此5个位点进行单一定点突变,得到5个突变体TBTR58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I。发酵24 h测其产量找出3个优势突变位点。以TBT-R58C为出发菌,依次对另外2个位点进行定点突变。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突变体。发酵24 h产量达到了1125.3 mg/L。与重组菌相比,TBT-R58C-T83I-H89Y的产量提高了53.6%。     

计算设计改造Thermobifida fusca 5-羧基-2-戊烯酰-辅酶A还原酶促进己二酸生产

为提高生物合成己二酸的能力,基于计算酶设计对5-羧基-2-戊烯酰-辅酶A还原酶的活性口袋进行改造。基于蛋白质和底物分子结构模型,通过对Ser 88、Leu 89、Ile 90、Pro 91、Ala 92、Val 93、Lys 95、Leu 96、Thr 161、Thr 246、Thr 249、Ile 250、Gln 253和Tyr 367这14个位点进行突变设计,以引入氢键网络来增强突变酶与5-羧基-2-戊烯酰-辅酶A的结合作用,继而提高酶促反应催化效率。在10个设计(Des0~Des9)中,Des0、Des3、Des4和Des9中底物的羧基可与设计的突变Gln253Arg和Ile250Gln形成氢键,且Gln253Arg可与突变Leu89Ser(Des0和Des9)或Leu89Thr(Des3和Des4)以及非设计位点Thr364形成氢键。为检验设计的合理性,该文通过分子动力学模拟分析设计的氢键的稳定性。结果表明,Des0设计中的4个氢键在16 ns分子动力学模拟过程中始终比较稳定,表明Des0可能与5-羧基-2-戊烯酰-辅酶A有较强的结合作用。据此,可推测Des0设计有可能提高催化5-羧基-2-戊烯酰-辅酶A反应的活性,可对其进行后续实验验证。     

新型天冬氨酸激酶突变株构建及酶学性质表征

通过定点随机突变技术,提高天冬氨酸代谢途径中首个关键限速酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)的催化活力,减弱或解除代谢产物对其协同反馈抑制,并通过Discovery Studio等软件对其空间结构进行分析,借助分子动力学模拟对其机制进行分析.首先选择ATP附近关键残基位点,在前期T379N/A380...     

基于氨基酸热点突变对腈水合酶底物亲和力的改造

目的:以Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶为研究对象,利用半理性设计以及定点突变以获取其对烟腈底物亲和力更高的突变体.方法:通过序列比对找到同源性很高的1AHJ蛋白并采用Swiss-Model和iTASSER等软件进行评估.利用Discovery Studio 2016(DS...     

产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及发酵培养基优化

该研究从自然界筛选出一株脂肪酶产生菌株,鉴定其种属并对其发酵培养条件进行研究。采集富油水样,利用罗丹明B培养基进行初筛,结合形态观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析进行菌种鉴定,建立系统发育树。结果表明,筛选出一株产脂肪酶的细菌U5,经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。通过单因素试验和响应面试验设计对发酵培养基中三丁酸甘油酯、葡萄糖、尿素添加量进行发酵优化。结果表明,最佳的发酵培养基组分为：三丁酸甘油酯2.0%（V/V）,葡萄糖9 g/L,尿素8 g/L。在此优化条件下,粗脂肪酶酶活为4.3 U/mL,比优化前的酶活提高了16.22%。     

在酿酒酵母中共表达sXYLA和XKS1及木糖发酵的初步研究

为改善重组酵母发酵木糖生产乙醇的能力,将定点突变改造后的Thermus thermophilus木糖异构酶基因sXYLA克隆到酵母表达载体pYX212并用于转化酸酒酵母Saccharomyces cerevisiae YPH499进行表达研究。酶活检测表明,改造后的木糖异构酶活性是未改造的1.91倍。在此基础上将改造后具有良好特性的木糖异构酶基因sXYLA和来自酸酒酵母的木酮糖激酶基因XKS1耦联,构楚得到重组表达质粒pYX-sXYLA- XKS1,在酿酒酵母YPH499中实现组成型共表达。结果表明,在84 h时重组菌发酵液酶活达到最高,木糖异构酶为0.624 U/mg蛋白,木酮糖激酶为0.688 U/mg蛋白。以葡萄糖和木糖为混合碳源初步进行半通氧发酵,代谢产物分析表明酸酒酵母重组菌木糖的消耗为4.75 g/L,乙醇的产量为0.839 g/L,分别比出发菌提高20.9%和14.8%,为酿酒酵母利用木糖发酵乙醇奠定基础。     

猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域的表达、纯化及其酶学性质分析

研究脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）在猪肉贮藏、加工过程中对脂肪氧化及风味形成的作用机制。通过序列分析和聚合酶链式反应扩增获得了猪肉12-脂肪氧合酶催化结构域（12-lipoxygenase catalytic domain,12-LOXcd）的编码基因,采用大肠杆菌表达系统,经镍柱亲和层析和Superdex G200凝胶过滤层析纯化得到12-LOXcd蛋白,并研究其酶学性质。结果表明,构建的原核表达载体pMBP-12-LOXcd在大肠杆菌中成功可溶性表达了猪肉12-LOXcd,该重组蛋白经纯化可达电泳纯。12-LOXcd以亚油酸为底物的比活力为2 826.7 U/mg,最适pH值为6.0,最适作用温度为30 ℃。亚油酸Km为0.40 mmol/L,亚麻酸Km为0.55 mmol/L,花生四烯酸Km为4.15 mmol/L,表明最适底物为亚油酸。与大豆LOX相比,该酶在较高NaCl质量分数（9%）时仍保持活性稳定;对热较不稳定,在60 ℃条件下失活,但优于大豆LOX的热稳定性;此外,12-LOXcd的pH值稳定性也优于大豆LOX,在碱性条件下仍能保留部分活力。     

Production of recombinant human lysosomal acid lipase in Schizosaccharomyces pombe: development of a fed-batch fermentation and purification process

A fed-batch fermentation process has been developed to enable the production of large quantities of recombinant human lysosomal acid lipase (hLAL; EC 3.1.1.13), in Schizosaccharomyces pombe, for preclinical studies as a potential enzyme therapy drug. Recombinant S. pombe, clone ASP397-21, expressed enzymatically active hLAL in the secreted form. A feedback fed-batch system was used to determine the optimal feed rate of a 50% glucose solution used as the carbon source. The feed rate of the glucose solution was calculated by a computer-aided system according to the equation; F=q(sf)(VX)/S(in) (q(sf), specific substrate feed rate [gram substrate/gram dry cell weight/h]; V, volume of culture broth [l]; X, cell density [gram dry cell weight/l]; S(in), concentration of growth limiting substrate in feed solution [gram substrate/gram feed solution]). At the time of the initial consumption of glucose in the batch-phase culture, the nutrient supply was automatically initiated by means of monitoring the respiratory quotient change. The obtained profile of the feed rate was applied to the feed forward control fermentation. Finally, the cells were grown up to >50 g dry cell weight/l, and the hLAL expression level was approximately 16,000 U/l. Expressed hLAL protein was purified in a two-step process by hydrophobic interaction and anion exchange chromatographies. Purified recombinant hLAL exhibited a 90-150 kDa broad band upon SDS-PAGE with specific activity of about 300 U/mg. After endoglycosidase H treatment, the band converged to 45 kDa, equal to the calculated molecular weight, suggesting that hLAL produced in S. pombe was hyper-glycosylated. N-terminal analysis of de-glycosylated hLAL revealed that the signal sequence of hLAL was correctly processed in S. pombe.     

硫酸软骨素ABC I酶的融合表达及传感器应用研究

采用MiSeq高通量测序技术对来凤地区盐渍藠头盐水细菌多样性进行解析,并采用PICRUSt技术对其基因功能进行预测。结果表明,99.58%的基因序列长度为425～451 bp,基本覆盖16S rRNA V3-V4区序列;优势细菌门为硬壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）,平均相对含量分别为43.94%、33.12%和18.21%;优势细菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和嗜热油菌属（Thermoleophilum）,平均相对含量分别为30.28%、18.21%和16.13%;共有219个核心操作分类单元（OTU）,包含的序列数占总序列数的75.56%;盐渍藠头盐水中可能共有大量具有较强氨基酸转运和代谢功能的细菌类群。     

菊粉酶基因克隆表达与油脂的组分分析

为了实现解脂亚罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）直接利用菊粉进行油脂生产,将外切菊粉酶基因INU1与表达质粒pINA1317连接,在解脂亚罗威亚酵母（Y. lipolytica）ACA-DC尿嘧啶缺陷突变菌株中表达。以尿嘧啶缺陷型筛选作为筛选标记获得转化子C37,经过培养菊粉酶酶活达到37.15 U/mL。在2 L发酵罐中,转化子C37以菊粉为底物进行发酵,油脂产量和细胞干质量分别为49%和14 g/L。脂肪酸分析结果显示棕榈酸、硬脂酸和油酸总和占总脂肪酸的92%以上,其中油酸含量高达59%,表明通过菊粉酶基因在解脂亚罗威亚酵母中的表达,实现了以菊粉为底物一步发酵产单细胞油脂。     

Isoleucine 259 and isoleucine 260 residues in Streptococcus gordonii soluble inorganic pyrophosphatase play an important role in enzyme activity

The hinge region of the family II soluble inorganic pyrophosphatase (PPase) found in Streptococcus gordonii DL1 (Challis) has previously been shown to play an important role in opening and closing of the active site between the N- and C-terminal domains of PPase. Amino acid residues isoleucine 259 (I259) and isoleucine 260 (I260) are highly conserved among catalytically active family II PPases and are located very close to the hinge region. Substitution of either I259 or I260 with a hydrophilic acidic amino acid (glutamate or aspartate) resulted in adverse effects on the kinetic properties of the enzyme. The I259/E and I259/D variants were nearly catalytically inactive (k(cat)/K(m) <0.2% of the wild type), whereas both I260/E and I260/D variants showed less than 15% of the catalytic efficiency of the wild type S. gordonii PPase. Conservative substitution of both residues to valine (I259/V, I260/V) showed no significant effect on the catalytic activity. The solvent accessibility data for I259 and I260 and the proximity of these amino acids to the hinge region suggest that occlusion of these residues may stabilise the closed and open conformations of the protein, respectively, thus aiding the catalytic activity of the enzyme.