抗青枯内生细菌的筛选及其对烟草青枯病的防治效果

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的一种土传细菌性烟草病害,主要危害烟草的根茎,严重影响烟草的产量。从青枯病发病田健康烟株分离内生细菌55个,通过平板拮抗实验筛选,R-3、R-7、R-9菌株对青枯雷尔氏菌有明显的拮抗作用。gyr B基因序列分析表明,R-3、R-7、R-9均为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。3个菌株的发酵液经115℃高温处理均能保持对青枯雷尔氏菌的抑制活性,说明3株贝莱斯芽胞杆菌可产生耐高温的抑菌物质。田间试验结果表明,R-3、R-7和R-9均可长期定殖于烟草根和茎中,对青枯病的防治效果分别为55.72%、48.34%和50.71%。     

重庆烟区青枯雷尔氏菌生化变种及序列变种的特性研究

为进一步明确重庆烟区烟草青枯菌的遗传及生化特性,采用生化变种分类标准及演化型复合PCR、系统发育进化分析对重庆10个烟草青枯病发生区县青枯雷尔氏菌的种下分化情况进行了研究。结果表明:46株烟草青枯雷尔氏菌均属于生化变种3和亚洲分支菌株(演化型Ⅰ)。内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA修复蛋白基因(mutS)部分序列的系统发育学分析表明:46株供试菌株可聚类到青枯雷尔氏菌演化型Ⅰ的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,其中序列变种17和44为优势菌株。表明重庆烟草青枯雷尔氏菌具有一定的遗传分化和地理区域特性。     

不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是烟草青枯病的病原菌。为有效防治青枯病,研究了不同培养条件对青枯雷尔氏菌生长的影响;并测定了在不同pH、温度以及在培养基中添加不同浓度的N、P、K、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、HCO₃^-、SO₄^2-对青枯雷尔氏菌生长的影响。结果表明,青枯雷尔氏菌在偏酸和偏碱条件下生长较好,青枯雷尔氏菌最适生长温度为25~45 ℃;高浓度的Zn²⁺和Cu²⁺能够有效抑制青枯雷尔氏菌的生长,其他因素对青枯雷尔氏菌的生长无明显作用。     

生物有机肥对烟草青枯病的防效及对土壤细菌群落的影响

烟草青枯病是一种危害严重的土传性病害,为了防治烟草青枯病,筛选了3株拮抗青枯雷尔氏菌的芽孢杆菌（甲基营养型芽孢杆菌JK3、枯草芽孢杆菌JK4和解淀粉芽孢杆菌JK10）,将其发酵液添加到有机肥中,经二次发酵后获得生物有机肥（SF2、SF4）,施入烟田。结果表明,生物有机肥能较好地防治烟草青枯病,同时促进烟株的生长,SF2、SF4处理的防效分别为82.18%、68.82%。同时,采用高通量测序技术分析了土壤细菌的群落结构,发现生物有机肥显著影响了土壤细菌的群落结构,促进了土壤中有益菌（如鞘氨醇单胞菌属、类芽孢杆菌属、耐热芽孢杆菌、梭菌属等）的增殖。芽孢杆菌和链霉菌的数量也明显增加,推测链霉菌和芽孢杆菌可抑制青枯雷尔氏菌的繁殖,进而控制烟草青枯病的发生。施用添加拮抗芽孢杆菌的生物有机肥是防治烟草青枯病的一项有效措施。     

基于锁核苷酸(LNA)增敏的植烟土壤青枯雷尔氏菌定量PCR检测

为了定量检测植烟土壤中青枯雷尔氏菌的数量,有效防控烟草青枯病,构建了一种锁核苷酸(LNA)荧光定量PCR检测方法。以青枯雷尔氏菌细胞色素c基因(Cyt c)(NCBI Genebank序列号:WP_011002214.1)为靶标,采用LNA技术合成覆盖目标片段的引物序列,结合荧光定量PCR技术,进行了植烟土壤中烟草青枯雷尔氏菌数量的快速检测。结果表明,所构建的Cyt c基因标准曲线的R~20.99,相关性较好。与普通DNA引物相比,采用Cyt c基因LNA引物进行的PCR适用退火温度更高,扩增效率也更高。通过对水稻土发病烟田18个土壤样品的检测,表明青枯雷尔氏菌数量在2.52×10~4~1.88×10~7个/g土壤之间。因此,构建的一种基于Cyt c基因的LNA增敏定量PCR检测体系,适用于水稻土等植烟土壤中青枯雷尔氏菌的定量检测,对烟田土壤的提前检测有助于烟草青枯病发生的预警。     

江西省抚州烟区青枯雷尔氏菌的分离鉴定与遗传多样性分析

为揭示青枯雷尔氏菌的遗传多样性,进而有效防治烟草青枯病,从江西省抚州市宜黄、黎川、乐安、广昌、资溪和南丰等烟叶产区采集青枯病发病烟株进行病菌分离,并以青枯雷尔氏菌种特异引物759/760进行PCR鉴定,获得了青枯雷尔氏菌33株。同时采用RAPD熔解曲线分析法(McRAPD)及内切葡聚糖酶基因(egl)测序法进行遗传多样性分析,确定其序列变种。McRAPD结果显示,多数青枯雷尔氏菌菌株遗传分化与地理来源相关性不强。egl基因测序结果表明,33株菌属于亚洲分支(演化型Ⅰ)的序列变种13、15、17和34,序列变种和地理来源具有较强相关性。序列变种15菌株占比最高,为57.6%,19株分离自广昌、黎川、乐安、南丰、宜黄和资溪等6县10个乡镇,是优势序列变种。序列变种17占比最少,为9.1%,3株全部分离自宜黄县黄陂镇。而4株序列变种34主要分离自乐安县增田镇,黎川县潭溪乡和资溪县高阜镇,占比12.1%。广昌县尖峰乡和头陂镇,南丰县傅坊乡和太源乡等产区在云烟87上分离到序列变种13,占分离菌株的21.2%,在江西省抚州市为首次发现。     

烟草青枯病病圃土壤微生物多样性初步分析

为了更好地利用烟草青枯菌拮抗菌防治烟草青枯病,采用微生物保守区域扩增、构建文库、生物信息比对的方法初步分析了烟草青枯病病圃土壤中微生物的多样性。结果显示,烟草青枯病病圃土壤微生物群落中含有伯克霍尔德氏菌(Burkholderia fungorum)、假单胞杆菌属类(Pseudomonas graminis)、黑霉菌(Aspergillus niger)、尖孢镰刀菌属(Fusarium oxysporum)等丰富的细菌类和真菌类微生物,也包括部分不可培养的微生物。土壤中微生物多样性的分析可以为青枯菌拮抗菌应用中拮抗菌在土壤中的定殖、扩繁过程研究提供部分微生物群落信息。     

邻苯二甲酸二丁酯降解菌对烟草青枯病的抑制作用

为有效防治烟草青枯病,采用细胞培养和毛细管法研究了烟草化感自毒物质邻苯二甲酸二丁酯对青枯菌的影响及趋化诱导效应,同时采用梯度训化法筛选邻苯二甲酸二丁酯降解菌,并通过盆栽试验测定了邻苯二甲酸二丁酯降解菌处理后的烟草青枯病发病率。结果表明,邻苯二甲酸二丁酯对青枯菌具有趋化诱导作用,并且在低浓度条件下能促进青枯菌生长;筛选的邻苯二甲酸二丁酯降解菌(Acinetobacter sp. Ed2)在土壤中对邻苯二甲酸二丁酯降解效率为51.17%;土壤中添加邻苯二甲酸二丁酯的处理(T1),与对照(CK)相比青枯菌数量显著提高59.89%;经邻苯二甲酸二丁酯降解菌Ed2处理(T2)后,与对照和T1处理相比,土壤中青枯菌数量分别降低84.63%和90.38%,青枯病发病率分别降低52.23%和136.42%。因此,利用邻苯二甲酸二丁酯降解菌消耗土壤中的邻苯二甲酸二丁酯,既减少青枯菌的营养供给,又截断邻苯二甲酸二丁酯对青枯菌的趋化诱导作用,从而显著降低了青枯病发病率。     

黑曲霉抗菌活性组分分离研究

黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属黑曲霉群霉菌,为低等真核生物。黑曲霉是集安全和具有许多活性强大酶系等诸多优点于一身的优良工业发酵用菌种。前期研究分离得到一株黑曲霉Aspergillus niger xj,其液体培养代谢物对根癌农杆菌、青枯雷尔氏菌、腐霉等常见农业病原菌有抑制作用。本文对黑曲霉的抗菌活性组分分离研究进行简要综述,对于进一步开发和利用黑曲霉这一真菌资源,研究开发新型的环境友好微生物杀菌剂具有较大的理论和实践意义。     

短小芽孢杆菌与化学杀细菌剂协同防治烟草青枯病研究

为探究短小芽孢杆菌与化学杀菌剂联合防控烟草青枯病的可行性,分别采用改良抑菌圈法和平板菌落计数法测定7种杀菌剂和短小芽孢杆菌AR03对青枯雷尔氏菌的毒力及杀菌剂与AR03的生物相容性,同时采用Horsfall法确定杀菌剂和AR03的复配比例。室内毒力试验结果表明,7种杀菌剂和AR03对青枯雷尔氏菌的生长均有较好的抑制作用。7种杀菌剂的毒力大小依次为三氯异氰尿酸、氯尿·硫酸铜、噻菌铜、溴菌·壬菌铜、甲霜·福美双、噻唑锌和中生菌素,EC₅₀值介于101.02~212.70 mg/L之间。浓度为1.0×10⁵~1.0×10⁹ cfu/mL的AR03对青枯雷尔氏菌的抑菌率介于26.13%~73.54%之间,呈现浓度依赖性。生物相容性分析发现7种供试药剂与AR03的生物相容性差异较大,短小芽孢杆菌AR03与噻菌铜、噻唑锌、甲霜·福美双生物相容性较好,尤其是噻菌铜表现最好,测试浓度100 mg/L时,菌落数大于1×10⁷cfu/mL。综合杀菌剂对青枯病菌的毒力及其与AR03生物相容性,噻菌铜表现最优。噻菌铜（EC₅₀=175.21 mg/L）与AR03（EC₅₀=6.84×10⁶ cfu/mL）复配剂在体积比为5∶5时,对青枯雷尔氏菌的抑制效果显著,增效作用明显,增效比率值I_R值为1.482。室内盆栽试验结果表明,菌药复配剂的防效（68.77%）明显优于单剂噻菌铜和生防菌AR03的防效,且混配剂中噻菌铜使用量只有单剂的1/2,大幅降低了化学药剂的使用量。     

烟草青枯病生防菌YH-22抗病机制的初步研究

通过菌株生态定殖以及抗病物质分析,初步探究解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）YH-22抗青枯病（茄科雷尔氏菌所致）的机制。采用利福平抗性诱导,获得抗400 μg/mL的抗性菌株以利于定殖研究。盆栽试验结果表明,YH-22先在烟草根际土壤定殖,然后依次进入根部、茎部。对YH-22菌株发酵上清液进行理化性质分析,发现抗茄科雷尔氏菌活性物质不溶于氯仿和乙酸乙酯,能溶于甲醇,具有一定的耐热性,能耐受胃蛋白酶和紫外线,具有排油和使液滴坍塌的特性。综上所述,生防菌YH-22在烟草根际土壤、根、茎均具有一定的定殖能力,其抗菌物质可能为蛋白质和脂肽的混合物。     

烟草青枯病拮抗菌在有机肥中的定殖效率及田间防治效果

为有效防治青枯病,采用多种拮抗菌复配菌剂添加至生物有机肥,施用于烟田,研究其对烟田土壤中有益微生物、病原微生物的影响及对青枯病的控制效果。结果显示,30%茶枯+70%烟草秸秆粉碎物（生物有机肥C）中添加的拮抗菌有较好的定殖率,枯草芽胞杆菌JK-4、解淀粉芽胞杆菌JK-10菌株在生物有机肥C中的定殖率分别达到了945.7%、1970%,链霉菌LC-7菌株在生物有机肥C中定殖率达到496.7%,同时其防治青枯病的效果最好,在烟草旺长期防治效果达到57.40%,在青枯病发病高峰期防治效果为37.11%。     

生物炭对根际土壤微生态的调控及对烟草青枯病的防控作用

  目的  探究不同用量的生物炭对根际土壤微生态的调控及对烟草青枯病的防控作用  方法  采用稀释平板法,研究生物炭对青枯菌的吸附作用及对其生长和运动性的影响;盆栽试验研究生物炭对烟草生长及青枯病发病情况和土壤基本理化性质的影响;利用高通量测序技术,比较各处理土壤细菌群落差异。  结果  （1）生物炭对青枯菌具有抑制作用,可吸附青枯菌、抑制其生长及运动性,用量超过1.5%时效果显著;（2）生物炭提高了土壤pH、有机质、速效磷和速效钾含量,利于烟草的生长。相关性分析发现,生物炭对土壤pH和化学性质的改善,是抑制烟草青枯病发生的主要原因;（3）生物炭提高了根际土壤微生物群落的Alpha多样性和放线菌门中链霉菌属的相对丰度;（4）根际土壤细菌结构的多样性与土壤理化性质有一定的相关性,其中有效钾影响最大。  结论  生物炭通过对青枯菌的抑制作用和对土壤微生态的改善,创造了利于烟草生长的环境条件,减少了烟草青枯病的发生。      

一株耐酸性拮抗细菌的筛选、鉴定及对茄雷尔氏菌的抑制作用

为解决酸化烟田青枯病防控难的问题，本研究通过生防菌快速筛选法获得一株耐酸性的拮抗细菌CLP-6，采用扫描电镜观察其拮抗活性，利用HPLC-MS技术确定胞外抑菌物质种类和含量，荧光定量PCR法检测筛选菌株对青枯菌的抑制效果。结果表明，该菌株胞外抑菌物质可降解青枯菌杆状菌体并致其死亡，pH 5.5条件最适宜该菌株生长，且胞外抑菌蛋白和抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚产量高。pH 5.5和pH 7.0土壤盆栽试验结果显示，在供试时间范围内，CLP-6能有效降低烟草根际土壤和茎基内青枯菌数量，且pH 5.5时抑菌效果更强，其中，接种192 h时，CLP-6处理烟草根际土壤青枯菌数量较CK处理分别减少98.12%和96.25%；接种144h时，pH5.5土壤条件下CLP-6处理烟草茎基内青枯菌数量最低，且显著低于CK处理。16Sr RNA,rpoD和rpoB多基因序列联合鉴定CLP-6为防卫假单胞菌（Pseudomonasprotegens）。新型耐酸性防卫假单胞菌CLP-6在减轻连作酸化土壤青枯菌侵染和提高烟草青枯病绿色防控效果具有重要开发前景。     

酸碱度对烟草青枯菌生长特性的影响

为探究酸碱度对烟草青枯菌生长特性的影响,在混合青枯菌的不同酸碱度土壤中测定烟草青枯病的发病情况。应用qRT-PCR方法测定不同酸碱度条件下烟草青枯菌的消长动态,通过结晶紫法和半固体培养基法分别测定青枯菌的生物膜和运动性在不同酸碱度条件下的变化。结果表明:烟草青枯病在弱酸性和中性(pH 6.0~7.0)土壤中发病严重。烟草青枯菌的消长动态结果显示,青枯菌数量在pH 6.5的土壤中最多,为9.1×108cfu·g~(-1) FW。烟草青枯菌生物膜成膜能力在pH 5.5时最强,pH 7.0时最弱。pH6.5时烟草青枯菌的运动性最强,pH 8.0时最弱。土壤酸碱度通过影响青枯病菌的消长、成膜能力和运动性进而影响烟草青枯菌对烟株的侵染。     

豫南烟区烟草青枯病危害调查及病原鉴定

2014年从豫南烟区信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县共采集25个疑似青枯病烟草病样和10份病土,分离纯化出菌株26个,测序所得的序列与NCBI数据库中的Ralstonia solanacearum基因组序列进行Blast比对,相似度达到98%以上,对分离鉴定得到的烟草青枯病菌进行回接试验,表现出典型的青枯病症状,发病组织在TTC培养基上也同样分离得到典型的青枯菌菌落,证实病原为烟草青枯病病原。由此表明,豫南烟区确有烟草青枯病的发生。     

SH7对烟草青枯病的抑菌、防病作用及其抑菌物质的初步研究

研究了生防细菌菌株SH7及其除菌发酵液对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的抑菌和防病作用,并对其产生的抑菌物质进行了粗提。结果显示,该菌株对R.solanacearum有很强的抑菌作用,且其除菌体发酵液对烟草青枯病的防效较好。将SH7无菌发酵液、无菌发酵液与青枯病菌混合30 min施入土壤29 d后,两种处理与对照相比,防效分别达到65.99%和53.2%;SH7菌株产生的抑菌物质是SH7除菌发酵液防病的主要机制;SH7分泌的抑菌物质可以被硫酸铵沉淀,初步认为该抑菌物质是蛋白类物质。     

烟草品种青枯病抗性的组培苗接种鉴定方法研究

由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病是制约我国烟草产业发展的瓶颈之一。选育抗病品种是防控该病最经济有效的策略。为探寻快速评价烟草品种青枯病抗性的方法,以6个抗感水平差异显著的烟草品种试管苗为研究对象,采用浸根接种法,评价了室内快速鉴定方法的可行性。结果显示,以浓度为3×10⁶ cfu/mL的青枯菌体悬液接种21 d后,红花大金元、翠碧1号、云烟85、K326、G80和岩烟97的病情指数分别为100.0、90.5、88.8、86.6、56.0和53.8,各品种试管苗的病情指数与田间自然发病情况呈明显正相关性,相关系数为0.936,达极显著水平。由此可见,室内无菌苗接种法能正确反映出不同烟草品种对青枯病的抗性水平,可作为快速、可靠评价烟草品种抗性水平的初筛手段。     

烟草青枯菌拮抗放线菌的筛选及鉴定

为筛选出烟草青枯菌的有效拮抗菌,本研究从烟草根围土壤中分离了97株放线菌,通过平板对峙培养法筛选出抑菌圈直径均达20 mm以上的拮抗放线菌3株.根据其在鉴别培养基上的培养特征、孢子和孢子链的形态特征,生理生化特性以及16SrDNA序列分析对这3株拮抗放线菌进行鉴定.结果表明,3株拮抗放线菌都属于链霉菌属(Streptomyces),分别为粉红孢类群中的玫瑰暗黄链霉菌(S. roseofulvus Preobrazhenskaya)、绿色类群中的橄榄绿链霉菌(S. olivaceoviridis Preobrazhenskaya)和灰褐类群中的黄麻链霉菌(S. corchorusii Ahmed).其中,玫瑰暗黄链霉菌菌株对青枯劳尔氏菌的拮抗效果最好,其平均抑菌圈直径可达54.66 mm;橄榄绿链霉菌菌株的拮抗效果次之,其平均抑菌圈直径为43.20 mm;黄麻链霉菌平均抑菌圈直径为20.34 mm.     

烈性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离与生物学特性分析

为采用噬菌体疗法防治烟草青枯病,以烟草青枯菌TB15-15为宿主菌,从土壤中筛选分离得到噬菌体,并采用双层平板法检测了噬菌体的效价、最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线以及噬菌体对温度和酸碱度的敏感性。结果表明:从长期植烟田块土壤中分离得到1株青枯雷尔氏菌烈性噬菌体,命名为RS-PⅡ-1。经检测该噬菌体最佳感染复数为1;一步生长曲线显示噬菌体潜伏期为10 min,爆发期持续100 min,裂解量为1 411;该噬菌体40℃活性最高,裂解量也最大,当温度超过40℃时活性逐渐下降,直至在60℃时活性丧失;噬菌体对酸碱均具有一定的耐受能力,pH在4~8范围内噬菌体均有很好裂解活性,当p H小于4或大于8,裂解活性均减小,特别是在p H大于11时,噬菌体裂解活性完全丧失,因此噬菌体RS-PⅡ-1不适合与碱性溶液混合应用。