烟田土壤带菌量与烟草青枯病发生的相关性分析

为快速、准确测定烟田土壤中青枯劳尔氏菌的数量及监测田间病害的发生动态,基于实时荧光定量PCR技术,构建了一种实时监测烟田土壤青枯劳尔氏菌的方法,并运用该方法检测了临沧、文山烟田土壤中的越冬菌量及青枯病发生时的土壤带菌量。结果表明,内切葡聚糖酶基因的特异引物RSf1/RSr1在烟草青枯劳尔氏菌中的扩增效率高、特异性强,构建的标准曲线C_T值与土壤带菌量具有良好的线性关系,相关系数为0.996 5,扩增效率为93.60%。田间青枯病的病情指数与土壤带菌量的C_T值负相关,病害越严重,C_T值越小。利用建立的qRT-PCR技术对烟田土壤越冬菌量和病害流行期间的土壤带菌量进行多次检测,结果表明越冬菌量与最终病情指数正相关,即越冬菌量越大,病害越严重。     

重庆烟区青枯雷尔氏菌生化变种及序列变种的特性研究

为进一步明确重庆烟区烟草青枯菌的遗传及生化特性,采用生化变种分类标准及演化型复合PCR、系统发育进化分析对重庆10个烟草青枯病发生区县青枯雷尔氏菌的种下分化情况进行了研究。结果表明:46株烟草青枯雷尔氏菌均属于生化变种3和亚洲分支菌株(演化型Ⅰ)。内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA修复蛋白基因(mutS)部分序列的系统发育学分析表明:46株供试菌株可聚类到青枯雷尔氏菌演化型Ⅰ的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,其中序列变种17和44为优势菌株。表明重庆烟草青枯雷尔氏菌具有一定的遗传分化和地理区域特性。     

客土改良对植烟土壤营养及烟草青枯病的影响

针对南雄烟区沙泥田烟草青枯病发病重的问题,采用大田试验方法,于植烟沙泥田耕层土壤中掺混了一定比例自然风化的红砂土(紫色土),研究了掺混后的土壤营养状况变化规律,并分析了沙泥田掺混红砂土对烟草青枯病的防治效果及原因。结果表明,在易发烟草青枯病的沙泥田耕层土壤中掺混红砂土150~450 m~3/hm~2后,土壤pH由酸性(4.78)渐变为中性(7.06),交换性钙离子含量增加了3~4倍,土壤中青枯病菌、细菌和真菌数量减少,而放线菌数量增加,青枯病发病率和病情指数比沙泥田分别下降了42.2%~73.5%和51.4%~81.1%。相关分析表明,pH、放线菌数量与青枯病发病率、病情指数均呈极显著负相关。在青枯病发病率高的植烟沙泥田耕层土壤中,掺混一定比例的红砂土可防治或减少烟草青枯病的发生。     

基于RAPD分子标记的烟草青枯病菌特异引物筛选及效果评价

为建立烟田土壤和烟株烟草青枯病菌的快速诊断方法,本研究采用RAPD方法筛选获得了6对可用于烟草青枯病菌PCR检测的特异性引物。经对6种细菌（烟草青枯病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌、荧光假单胞菌、野火病菌）和2个烟草品种（中烟100和云烟87）的检测验证,6对引物均具有良好的灵敏度、特异性和可靠性。对青枯菌菌液DNA的检测灵敏度可达0.42 pg/μL,对土壤青枯菌的最低检出率为6×102 cfu/g。应用特异引物A1T和S13T可对接种土壤和烟株样品的研磨悬浮液直接进行PCR快速检测,显著地缩短了检测时间,对烟叶产区烟草青枯病的预测预报及防控具有重要意义。      

生物有机肥对烟草青枯病的防效及对土壤细菌群落的影响

烟草青枯病是一种危害严重的土传性病害,为了防治烟草青枯病,筛选了3株拮抗青枯雷尔氏菌的芽孢杆菌（甲基营养型芽孢杆菌JK3、枯草芽孢杆菌JK4和解淀粉芽孢杆菌JK10）,将其发酵液添加到有机肥中,经二次发酵后获得生物有机肥（SF2、SF4）,施入烟田。结果表明,生物有机肥能较好地防治烟草青枯病,同时促进烟株的生长,SF2、SF4处理的防效分别为82.18%、68.82%。同时,采用高通量测序技术分析了土壤细菌的群落结构,发现生物有机肥显著影响了土壤细菌的群落结构,促进了土壤中有益菌（如鞘氨醇单胞菌属、类芽孢杆菌属、耐热芽孢杆菌、梭菌属等）的增殖。芽孢杆菌和链霉菌的数量也明显增加,推测链霉菌和芽孢杆菌可抑制青枯雷尔氏菌的繁殖,进而控制烟草青枯病的发生。施用添加拮抗芽孢杆菌的生物有机肥是防治烟草青枯病的一项有效措施。     

抗青枯内生细菌的筛选及其对烟草青枯病的防治效果

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的一种土传细菌性烟草病害,主要危害烟草的根茎,严重影响烟草的产量。从青枯病发病田健康烟株分离内生细菌55个,通过平板拮抗实验筛选,R-3、R-7、R-9菌株对青枯雷尔氏菌有明显的拮抗作用。gyr B基因序列分析表明,R-3、R-7、R-9均为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。3个菌株的发酵液经115℃高温处理均能保持对青枯雷尔氏菌的抑制活性,说明3株贝莱斯芽胞杆菌可产生耐高温的抑菌物质。田间试验结果表明,R-3、R-7和R-9均可长期定殖于烟草根和茎中,对青枯病的防治效果分别为55.72%、48.34%和50.71%。     

试验土壤中烟草青枯病菌的RT-qPCR检测分析

为有效防治烟草青枯病,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantity PCR,RT-qPCR)技术,对土壤中烟草青枯病菌进行了定量检测,并建立了土壤中烟草青枯病菌的RT-qPCR检测方法。结果表明,该方法对试验土壤青枯菌的最低检测浓度为5×10~2cfu/g土壤,RT-qPCR检测技术对土壤中烟草青枯病菌的灵敏度比常规PCR检测技术提高了10倍。     

基于锁核苷酸(LNA)增敏的植烟土壤中烟草黑胫病菌定量PCR检测方法

为了快速有效地检测植烟土壤中的烟草黑胫病菌的定殖数量,以一种锁核苷酸(LNA)引物为基础,进行了植烟土壤中烟草黑胫病菌数量的定量PCR 检测方法研究。结果表明:①与普通DNA引物相比,LNA 引物提高了PCR 反应的退火温度,减少了引物二聚体和非特异性产物的形成,提高了烟草黑胫病菌分子检测的灵敏度与特异性;②定量分析检测出14 个烟草-大蒜轮作土样中烟草黑胫病菌的定殖数量为2.76×103～5.20×104个/g,且在4～5 h 内完成检测,具有较高的灵敏度和检测效率。      

不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是烟草青枯病的病原菌。为有效防治青枯病,研究了不同培养条件对青枯雷尔氏菌生长的影响;并测定了在不同pH、温度以及在培养基中添加不同浓度的N、P、K、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、HCO₃^-、SO₄^2-对青枯雷尔氏菌生长的影响。结果表明,青枯雷尔氏菌在偏酸和偏碱条件下生长较好,青枯雷尔氏菌最适生长温度为25~45 ℃;高浓度的Zn²⁺和Cu²⁺能够有效抑制青枯雷尔氏菌的生长,其他因素对青枯雷尔氏菌的生长无明显作用。     

休耕对连作障碍植烟土壤酶活性及细菌群落结构的影响

为揭示休耕对连作障碍土壤微生态环境的影响机制,选择常年连作烟草且青枯病发生严重的烟田为研究对象,研究了休耕对土壤酶活性及土壤细菌群落结构的影响。结果表明,休耕措施能有效提高连作烟田有机质、碱解氮含量和土壤酶活性,特别是休耕两年后土壤蔗糖酶、过氧化氢酶活性比未休耕烟田分别增加147.85%、64.13%。休耕措施有利于提高土壤细菌群落的丰富度,随着休耕年限的增加Chao指数与Shannon指数呈增加趋势,Simpson指数呈降低趋势。休耕后土壤中的有益菌酸杆菌门(Acidobacteria)和有益菌玫瑰弯菌属(Roseiflexus)均明显高于连作烟田,而致病菌青枯雷尔氏菌则明显低于连作烟田。休耕一年、两年的烟田青枯病发病率比连作烟田分别降低22.62%和32.55%。因此,休耕能改善连作障碍植烟土壤的微生态环境,提高土壤肥力,降低烟田青枯病的发病率。     

江西省抚州烟区青枯雷尔氏菌的分离鉴定与遗传多样性分析

为揭示青枯雷尔氏菌的遗传多样性,进而有效防治烟草青枯病,从江西省抚州市宜黄、黎川、乐安、广昌、资溪和南丰等烟叶产区采集青枯病发病烟株进行病菌分离,并以青枯雷尔氏菌种特异引物759/760进行PCR鉴定,获得了青枯雷尔氏菌33株。同时采用RAPD熔解曲线分析法(McRAPD)及内切葡聚糖酶基因(egl)测序法进行遗传多样性分析,确定其序列变种。McRAPD结果显示,多数青枯雷尔氏菌菌株遗传分化与地理来源相关性不强。egl基因测序结果表明,33株菌属于亚洲分支(演化型Ⅰ)的序列变种13、15、17和34,序列变种和地理来源具有较强相关性。序列变种15菌株占比最高,为57.6%,19株分离自广昌、黎川、乐安、南丰、宜黄和资溪等6县10个乡镇,是优势序列变种。序列变种17占比最少,为9.1%,3株全部分离自宜黄县黄陂镇。而4株序列变种34主要分离自乐安县增田镇,黎川县潭溪乡和资溪县高阜镇,占比12.1%。广昌县尖峰乡和头陂镇,南丰县傅坊乡和太源乡等产区在云烟87上分离到序列变种13,占分离菌株的21.2%,在江西省抚州市为首次发现。     

邻苯二甲酸二丁酯降解菌对烟草青枯病的抑制作用

为有效防治烟草青枯病,采用细胞培养和毛细管法研究了烟草化感自毒物质邻苯二甲酸二丁酯对青枯菌的影响及趋化诱导效应,同时采用梯度训化法筛选邻苯二甲酸二丁酯降解菌,并通过盆栽试验测定了邻苯二甲酸二丁酯降解菌处理后的烟草青枯病发病率。结果表明,邻苯二甲酸二丁酯对青枯菌具有趋化诱导作用,并且在低浓度条件下能促进青枯菌生长;筛选的邻苯二甲酸二丁酯降解菌(Acinetobacter sp. Ed2)在土壤中对邻苯二甲酸二丁酯降解效率为51.17%;土壤中添加邻苯二甲酸二丁酯的处理(T1),与对照(CK)相比青枯菌数量显著提高59.89%;经邻苯二甲酸二丁酯降解菌Ed2处理(T2)后,与对照和T1处理相比,土壤中青枯菌数量分别降低84.63%和90.38%,青枯病发病率分别降低52.23%和136.42%。因此,利用邻苯二甲酸二丁酯降解菌消耗土壤中的邻苯二甲酸二丁酯,既减少青枯菌的营养供给,又截断邻苯二甲酸二丁酯对青枯菌的趋化诱导作用,从而显著降低了青枯病发病率。     

一株耐酸性拮抗细菌的筛选、鉴定及对茄雷尔氏菌的抑制作用

为解决酸化烟田青枯病防控难的问题，本研究通过生防菌快速筛选法获得一株耐酸性的拮抗细菌CLP-6，采用扫描电镜观察其拮抗活性，利用HPLC-MS技术确定胞外抑菌物质种类和含量，荧光定量PCR法检测筛选菌株对青枯菌的抑制效果。结果表明，该菌株胞外抑菌物质可降解青枯菌杆状菌体并致其死亡，pH 5.5条件最适宜该菌株生长，且胞外抑菌蛋白和抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚产量高。pH 5.5和pH 7.0土壤盆栽试验结果显示，在供试时间范围内，CLP-6能有效降低烟草根际土壤和茎基内青枯菌数量，且pH 5.5时抑菌效果更强，其中，接种192 h时，CLP-6处理烟草根际土壤青枯菌数量较CK处理分别减少98.12%和96.25%；接种144h时，pH5.5土壤条件下CLP-6处理烟草茎基内青枯菌数量最低，且显著低于CK处理。16Sr RNA,rpoD和rpoB多基因序列联合鉴定CLP-6为防卫假单胞菌（Pseudomonasprotegens）。新型耐酸性防卫假单胞菌CLP-6在减轻连作酸化土壤青枯菌侵染和提高烟草青枯病绿色防控效果具有重要开发前景。     

酸碱度对烟草青枯菌生长特性的影响

为探究酸碱度对烟草青枯菌生长特性的影响,在混合青枯菌的不同酸碱度土壤中测定烟草青枯病的发病情况。应用qRT-PCR方法测定不同酸碱度条件下烟草青枯菌的消长动态,通过结晶紫法和半固体培养基法分别测定青枯菌的生物膜和运动性在不同酸碱度条件下的变化。结果表明:烟草青枯病在弱酸性和中性(pH 6.0~7.0)土壤中发病严重。烟草青枯菌的消长动态结果显示,青枯菌数量在pH 6.5的土壤中最多,为9.1×108cfu·g~(-1) FW。烟草青枯菌生物膜成膜能力在pH 5.5时最强,pH 7.0时最弱。pH6.5时烟草青枯菌的运动性最强,pH 8.0时最弱。土壤酸碱度通过影响青枯病菌的消长、成膜能力和运动性进而影响烟草青枯菌对烟株的侵染。     

青枯雷尔氏菌拮抗放线菌的筛选及其抗菌活性物质的分离

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的土传性病害。从健康土壤中分离到对青枯雷尔氏菌具有明显拮抗作用的放线菌LC-7,经初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)。链霉菌LC-7的发酵液用氯仿、正丁醇萃取后,通过捷克八溶剂系统分析,判定该抗菌物质为碱性水溶性抗生素。抗菌物质进一步采用离子交换树脂纯化,并经醇沉后,获得抗生素的结晶,再用HPLC进一步纯化后并进行质谱分析可得出,LC-7所产抗菌活性物质为一种新的氨基糖苷类抗生素,其分子量为365.1。田间试验表明,链霉菌LC-7对烟草青枯病具有显著的防治效果,防效为85.48%。     

湖北恩施地区烟草青枯菌的生理分化研究

本研究对湖北恩施烟区青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的生理小种、生化型和演化型进行了鉴定,为湖北省烟草青枯病抗性品种的选育和利用提供了理论依据。从湖北恩施地区的8个县（市）采集青枯病感病烟株,通过平板稀释分离和特性性引物检测从中分离鉴定到54个具有致病性的烟草青枯菌菌株。采用注茎接种法将供试菌株分别接种青枯菌6个鉴别寄主,确定所有的菌株均属于生理小种1;基于青枯菌对3种双糖和3种己醇利用能力的检测结果,将54个菌株鉴定为生化型Ⅲ;经青枯菌演化型PCR检测,54个菌株均能扩增得到片段大小分别为280 bp和144 bp的两条特异性条带,这说明全部分离菌株均属于青枯菌演化型Ⅰ型。     

皖南烟田三种土传病原物分子检测

为检测皖南烟田土传病害的分布,2011-2012年从皖南烟区烟田共采集土样51份,采用分子生物学方法对烟田土壤进行了烟草黑胫病、根黑腐病和青枯病检测。结果显示,烟田土壤中烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和青枯病菌的阳性率分别为19.6%、41.2%和56.9%,3种烟草土传病原菌在皖南烟区多数烟田均有分布,其中青枯病菌检出率最高。本研究证明了应用分子生物学方法检测土传病原菌的可能性,生产上可为烟草种植提供理论依据。     

烤烟青枯病田间发生动态及其与气象因素的相关性

2013-2014年对南平建阳烟田土壤青枯病菌数量和发病情况进行了系统调查,分析了病害与主要气象因子的相关性。结果表明,SMSA半选择性培养分离法和荧光定量PCR法均能有效检测土壤中青枯病菌,前者检测的青枯病菌数量与病情指数相关性（R²=0.8191）高于后者（R²=0.7464）。空气温度、湿度、降水和日照时数等气象因子中,温度是影响南平烟田青枯病菌数量和发病程度的关键气象因子。5月下旬至6月初,周平均温度高于22℃时,病害进入始发期,此时根际土壤中病菌数量高于5.0×10⁵ cfu/mL。6月上旬至中旬,周平均温度在22~25℃,病害处于平稳发展期,青枯病菌数量在1.0×10⁵~2.2×10⁶ cfu/g。6月中下旬,周平均气温高于25℃,病害进入爆发期,青枯病菌数量在2.2×10⁶ cfu/g以上。温度对于指导青枯病的预测预报和防治具有重要价值。     

套种大蒜对烟田土壤微生物群落及烟叶品质的影响

为探明烟田套种大蒜后土壤微生物群落变化,特别是烟田土壤中烟草根茎病菌的数量及对烟叶内在品质影响,在龙岩烟区开展了套种大蒜对烟田土壤微生物及烟叶品质影响试验。结果表明,烟田套种大蒜能明显减少烟田土壤中细菌、真菌数量,特别是减少烟草青枯菌和黑胫病菌数量,而增加烟田放线菌数量。套种大蒜对烟叶内在化学成分及烟叶评吸质量无明显负面影响。在烟草根茎病严重的局部烟田可通过套种大蒜控制该类病害的发生与危害,从而减少化学农药的使用,提高烟叶安全性,减少环境污染。     

调节植烟土壤酸度防控烤烟青枯病

针对植烟土壤退化、微生态环境失衡和青枯病为害严重等问题,设置了石灰1500kg/hm2、草木灰18000kg/hm2和煤炭灰18000kg/hm2三种土壤改良剂对植烟土壤进行修复。分析植烟土壤pH值、交换性酸总量、细菌、真菌、放线菌和青枯病病原菌变化及调查各处理青枯病的发病情况,探索不同土壤改良剂对植烟土壤修复及对青枯病防控效果的影响。结果表明,移栽后120天,石灰、草木灰和煤炭灰处理的植烟土壤pH值较CK分别提高了8.85%、17.28%和7.61%;放线菌数量分别较CK增加了126.57%、125.87%和185.31%;青枯菌数量分别较CK降低了25.15%、46.81%和14.11%;移栽后90天为青枯病发病高峰期,石灰、草木灰和煤炭灰处理对青枯病的相对防效分别为49.30%、69.02%和16.90%。综合研究表明,3种土壤改良剂对植烟土壤修复及烟草青枯病防控均有一定的效果,且以草木灰18000kg/hm2效果最佳,其次为石灰1500kg/hm2。