融合蛋白sCAR-TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1(TSP-1)氨基酸序列(RFYVVMWK),以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR-TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白（PPA）的亚基B（PPAb）的融合蛋白,将PPA6基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后荻得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。N时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad—EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

sCAR-PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

为获得腺病毒受体sCAR与掌叶半夏蛋白(PPA)的亚基B(PPAb)的融合蛋白,将PPAb基因克隆入已构建的原核表达载体pQE30-sCAR中,经PCR和测序鉴定正确的重组质粒pQE30-sCAR-PPAb,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-PPAb。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在42 kD左右有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-PPAb能提高Ad-EGFP对Kasumi-1的感染效率。     

CTB-InsB融合基因在大肠杆菌中的表达研究

构建了一种霍乱毒素B亚基（CTB）与人胰岛素B链（InsB）的融合基因，并克隆入表达载体pGEX-4T-1中，命名为pGEX—CTB-InsB。该融合蛋白在大肠杆菌中的表达产物以包涵体形式存在，分子量约为43kDa。包涵体经溶解和复性后，使用GSTrapFF亲和层析柱纯化得到融合蛋白。经SDS-PAGE和Western免疫印迹分析证实纯化蛋白为重组目的蛋白。     

Lrrcl0蛋白表达载体的构建

为了构建重组质粒pET～Lrrcl0和Lrrcl0蛋白表达,利用NcoI和BamHI双酶切载体pMDl8-T-Lrrcl0,回收目的片段与经同样酶切后的表达载体pET-30a（＋）,转入E．colistrainDH5d．茵落PCR筛选阳性茵落,提取阳性茵质粒并进行PCR和酶切鉴定;将重组子转入E．colistrainB121（DE3）,于37℃振荡培养,用1mmol／LIPTG诱导目的蛋白的表达。结果表明,成功构建了融合表达载体并命名为pET-Lrrcl0。转入E．colistrainBL21（DE3）进行目的蛋白的表达,获得与预期分子量大小相一致的融合表达蛋白Lrrcl0;Lrrcl0蛋白以包涵体形式存在于宿主菌中,且IPTG诱导4小时,目的蛋白表达量最大。     

小麦病程相关蛋白wheatwin 1的表达及其对黄曲霉生长及产毒的影响

黄曲霉在储粮中的大量生长可严重危害粮食的储藏品质甚至产生真菌毒素。研究表明,小麦籽粒中含有多种病程相关蛋白,具有较强储藏霉变抗性的小麦品种胚部含有较多的病程相关蛋白,但其对储粮霉菌的生长和产毒的影响尚不清楚。通过PCR手段扩增从小麦基因组DNA中扩增出了病程相关蛋白wheatwin 1基因并将其在大肠杆菌中进行了表达,对wheatwin 1蛋白进行复性和纯化后分析其对黄曲霉生长及产生毒素的影响。结果表明编码成熟wheatwin 1蛋白的DNA序列长度为378 bp,将其在大肠杆菌中与谷胱甘肽转移酶融合表达可获得包涵体蛋白。将包涵体蛋白复性并利用Thrombin酶切后获得了具有核酸酶活性的wheatwin 1,其可降解黄曲霉RNA;进一步研究表明100 g/m L wheatwin蛋白可显著抑制黄曲霉孢子的萌发和黄曲霉毒素的积累。为进一步揭示wheatwin蛋白对黄曲霉生长和产毒的机理研究奠定了基础。     

带跨膜片段的α-PEC的分子构建

通过分子设计构建一段来自人红细胞膜上的血型糖蛋白A（glycophorin A，GPA）中的跨膜片段基因，并连接到藻红蓝蛋白基因片段（pecA）的N端，将融合基因插入到表达载体pET30a进行表达。表达产物以包涵体形式存在，通过优化条件使其溶解，并与藻蓝胆素PCB在裂合并构酶PecE／PecF催化下进行体外重组，通过可逆光致变色活性大小确定包涵体溶解的最佳条件。结果表明，超声后的细胞加入终浓度8mol／L尿素，0．2％Triton X-100和一定量的PecE和PecF，透析时采用含0．2％Triton X-100的尿素梯度透析可使重组活性最高。研究为可逆光致变色生物材料在生物光电材料中的应用打下了基础。     

人APOBEC3G基因克隆、表达、纯化及多克隆抗体制备

为了获得人APOBEC3G蛋白及其多克隆抗体,从H9细胞中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得人APOBEC3G基因.将测序鉴定过的APOBEC3G基因克隆到原核表达载体pET-32a上,以包涵体的形式在E.coli BL21(DE3)中高效表达,由于APOBEC3G蛋白C端融合了6×His标签,有助于对蛋白的纯化及鉴定.应用酶切技术、SDS-PAGE及Western Blot等方法确保基因片段的正确性和蛋白的特异性.纯化后的APOBEC3G蛋白用来免疫日本大耳白兔,用间接ELISA法测定兔多克隆抗体滴度,获得了纯度超过80%的APOBEC3G融合蛋白,抗APOBEC3G多克隆抗体滴度高达1:102 400.     

小麦麦谷蛋白高分子量亚基N端序列克隆及原核表达分析

为了探究麦谷蛋白高分子量亚基(HMW-GS)的N-末端结构域对面粉品质的影响,以HMW-GS的1Dx5的N-末端结构域(1Dx5-N)为目的基因进行序列克隆及原核表达,研究大肠杆菌BL21(DE₃)为载体菌进行转化,鉴定阳性克隆,以IPTG和乳糖作为诱导剂,并通过正交试验,筛选最佳的诱导条件。结果表明：1Dx5-N序列基因全长267 bp,共编码氨基酸89个,预测分子质量为16.211 kDa;经转化、阳性克隆鉴定后,证明了该表达载体能够在大肠杆菌中稳定遗传;IPTG和乳糖均可诱导1Dx5-N进行表达;SDS-PAGE表明1Dx5-N重组蛋白多为包涵体蛋白;IPTG诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃,浓度0.6 mmol/L,诱导时间16 h;乳糖诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃、质量浓度9 g/L、诱导时间16 h。通过对比发现,乳糖可代替IPTG诱导1Dx5-N蛋白表达。     

蛇毒类凝血酶基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

将大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶（Gloshedobin）基因克隆到载体pET32－a（＋）上，在T7lac启动子下以N端融合硫氧还蛋白的形式在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，诱导条件为：30℃诱导6h，IPTG浓度为1mmol/L。利用固定化金属离子（Ni^2 ）亲和层析分别对胞内可溶物和变性条件下的包涵体进行纯化。通过SDS－PAGE检测融合蛋白的纯度，采用点杂交和纤维蛋白凝结活性检测分析，显示纯化产物具有较高生物 活性。     

大气混合污染物对大鼠肺脏中血红素氧合酶1表达的影响

通过观察大气污染物引起大鼠肺损伤的病理组织学变化,分析肺组织内血红素氧合酶1（HO-1）的表达量的变化,为大气污染所致肺损伤的生物学标记物的研究提供科学依据。实验方法如下：将30只Wistar大鼠,随机分为3个实验组（3d、7d、30d组）和3个对照组（3d、7d、30d组）,对实验组大鼠染尘染毒后提取所有大鼠肺组织,观察其病理组织学变化;RT-PCR技术检测各组肺组织中HO-1的mRNA表达;Western-blot技术检测各组肺组织中HO-1蛋白的表达。结果显示：实验组（7d及30d）的肺组织病理形态学评分显著高于对照组（7d及30d）,实验组（7d及30d）大鼠肺组织HO-1mRNA表达与对照组相比,具有显著性差异（P均〈0.05）。随着吸入大气混合污染物的时间延长,肺组织内的HO-1蛋白表达水平逐渐增高,实验组（7d及30d）与对照组（7d及30d）相比,差异有显著性意义（P〈0.05）。在吸入大气混合污染物后早期（7d）,HO-1转录水平升高。持续吸入混合大气污染物（30d）,大鼠肺组织出现明显的病理组织学变化,HO-1转录水平、蛋白表达水平均比对照组明显升高。得出结论：可将HO-1作为大气混合污染物所致的肺损伤的早期生物学标记物;采取某些手段增加肺组织HO-1的表达,可能会减少混合大气污染物对肺组织造成的损伤。     

约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究

通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25（217AA）和Pys48（455AA）,以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。     

pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA毕赤酵母表达载体的构建和表达

将掌叶半夏凝集素和死亡素的融合基因thanatin-linker-ppa定向连接到pPIC3．5K,构建酵母表达载体pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA并进行序列分析,经SalI单酶切线性化后电转化到GSll5毕赤酵母感受态细胞中,PCR鉴定后在含有G418抗性的YPD平板筛选高拷贝重组子。利用甲醇在BMMY培养基中诱导表达融合蛋白,经SDS-PAGE和Westernbloting分析显示获得分子量约31kD的融合蛋白,融合蛋白经纯化后MTT分析其抗肿瘤活性,结果显示融合蛋白具有显著的抗肿瘤效果。     

Notch1在宣威女性肺癌患者中的表达及临床意义

为研究宣威女性肺癌中Notch1的表达及其临床意义,采用免疫组化SP法检测54例宣威女性肺癌组织及远端正常肺组织中Notch1的表达,并结合患者临床资料,探讨Notch1在宣威女性肺癌患者中的作用.结果显示,Notch1蛋白主要表达于细胞质,在宣威女性肺癌中的阳性表达显著高于远端正常肺组织(P0.05);Notch1蛋白在不同临床分期、分化程度及淋巴结转移与否患者中的表达差异有统计学意义(P0.05).生存分析显示:Notch1蛋白阳性表达组的中位生存期为27个月,而阴性表达组为38个月(P0.05),无淋巴结转移患者的中位生存期较有淋巴结转移患者长,进展期患者的中位生存期短于早期患者(P0.05),多因素Cox风险回归模型显示:宣威女性肺癌预后判断的独立影响因素为病理分期.提示Notch1基因在宣威女性肺癌组织中存在异常表达升高,且Notch1蛋白阳性表达的患者中位生存时间相对较短.Notch1蛋白的表达水平对于判断宣威女性肺癌患者预后有一定的指导意义.     

焊后热处理对高温合金异种材料焊接组织的影响

针对含有较多合金元素的镍基单晶高温合金熔焊焊接性能较差的问题,采用扫描电子显微镜、背散射衍射分析和显微硬度仪等手段,研究了镍基单晶高温合金DD8和钴基等轴晶K640M的氩弧焊焊接显微组织特征.结果表明,焊接后接头形成定向柱晶区、熔合区和母材区.对实验合金进行焊后热处理后发现,熔合区和定向柱晶区中γ相发生长大,且Co等元素的分布趋于均匀,焊接残余应力的存在导致个别位置出现再结晶现象.热处理前后接头内显微硬度无明显变化.     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区（命名为Kago2）,构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

乳铁蛋白对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用及机制

研究乳铁蛋白（1actoferrin,LF）对脂多糖诱导的急性肺损伤（acute lung injury,ALI）的保护作用,并探讨其可能机制．清洁级雄性昆明小鼠腹腔注射LPS5mg／kg前1h或注射LPS后1h给予LF5mg／body,同时以2mg／kg地塞米松治疗组为阳性对照组．给予LPS12h后,收集左肺肺泡灌洗液．检测白细胞介素-10及肿瘤坏死因子-α的含量、总蛋白含量;离心后将沉淀重悬检测灌洗液中总细胞数．取右肺上叶速冻于-80℃冰箱,检测肺组织中髓过氧化物酶含量;中叶称湿、干重,计算肺湿／干重比;下叶进行HE染色,观察肺组织病理学改变．结果发现,LF能明显减轻肺泡腔出血、水肿、炎细胞浸润等病理过程,肺组织病理学评分明显降低（P〈0．05）;LF能降低肺组织MPO活性、肺泡灌洗液中总细胞、总蛋白含量、W／D和TNF-α含量（P〈0．05）;增加肺组织IL-10含量（P〈0．05）．这些结果说明,LF对LPS诱导的急性肺损伤有显著的预防和治疗作用．