雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨

探讨了雨生红球藻(Haematoccuspluvialis)712株的适宜培养条件及藻体诱导累积虾青素的培养基条件。重点研究了温度、pH和光照条件对雨生红球藻营养生长的影响,以及NaNO3、Fe2+盐和乙酸钠浓度对雨生红球藻诱导累积虾青素含量的影响。结果表明:24℃、1000～1500lx连续光照、pH8.0左右的生长条件适合雨生红球藻游动细胞增殖,使平均生长速率达到0.252/d。通过正交试验表明:缺氮培养基对于雨生红球藻细胞累积虾青素最为有利,虾青素含量达到6.72μg/mL,而FeSO4和乙酸钠浓度对虾青素的累积无显著性影响。     

不同温度下雨生红球藻优良藻株筛选

为获得适宜大规模培养的藻株,研究和比较了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)3个不同品系分别在15、20、25、30℃中的生长和虾青素积累情况。结果表明,温度对雨生红球藻的生长和虾青素积累有显著的影响,并且与藻种品系有关。各培养温度下,雨生红球藻藻株H3的细胞密度、藻细胞干重、虾青素含量和产量具有明显优势。藻株H3的最适生长温度为15℃,其最终细胞密度和细胞干重分别为11.75×10~4 cell/mL和0.337 g/L,但该条件不利于虾青素的积累;虾青素积累在20℃培养时最高,其虾青素含量和产量分别为1.15%、3.41 mg/L;而在30℃时生物量和虾青素产量均最低。因此,优先选择H3作为大规模培养的藻种。     

利用控pH流加培养法提高雨生红球藻的生物量及虾青素产量

研究了一种新型培养方法——控pH流加培养法,可有效促进雨生红球藻生长并提高虾青素产量。测定雨生红球藻生长期间对营养盐的需求量,依据对数生长期藻液pH与硝酸盐和磷酸盐的含量的线性关系,确定流加液组成及流加方法。流加液的组成为7.88 g/L的KNO3,1.83 g/L的KH_2PO_4和24.0 g/L的CH_3COONa,监测对数生长期藻液pH变化情况,通过添加流加液将藻液的pH值持续控制在7.5~8.0内,雨生红球藻的细胞干重可达(1.42±0.04)g/L,虾青素产量可达(60.23±1.81)mg/L。     

雨生红球藻虾青素积累条件优化研究

虾青素具有很强的抗氧化能力,雨生红球藻在目前已知生物中虾青素含量最高。该文采用响应面法研究温度、pH值、NaCl浓度、钨酸钠浓度对雨生红球藻虾青素积累的影响。结果表明,雨生红球藻虾青素积累的最佳工艺条件为温度27℃、pH 9.6、NaCl浓度1.7 g/L、钨酸钠浓度5.2 mmol/L。各因素对雨生红球藻虾青素积累影响的顺序为pH值＞温度＞钨酸钠浓度＞NaCl浓度。     

光照、氮素和高盐胁迫对雨生红球藻积累虾青素的影响研究

为摸索雨生红球藻积累虾青素的最优条件,研究光照强度、NaNO_3和NaCl浓度对雨生红球藻光合作用和积累虾青素的影响,结果表明:不同光照强度处理组最大光能转化效率(Fv/Fm)较对照组均显著降低(P 0.05);试验第24天,光照强度为236μmol/m~2/s的试验组微藻积累虾青素达最高值9.01 mg/L;NaCl浓度为10 g/L和12.5 g/L时雨生红球藻Fv/Fm和有效光能转化效率值(Yield)均低于对照组,而NaCl浓度为5 g/L时微藻Fv/Fm和Yield值均高于对照组,NaCl浓度为5、7.5、10 g/L时微藻积累虾青素水平显著高于其他试验组(P 0.05),试验第24天,NaCl浓度为7.5 g/L时,微藻积累虾青素含量达到最高,较对照组提高了34.4%;NaNO_3浓度为0、0.032、0.065 g/L时,雨生红球藻Fv/Fm整体呈先上升后缓慢降低的趋势,较对照组差异显著(P 0.05),在氮胁迫处理条件下雨生红球藻积累虾青素含量逐渐升高,试验第22天后细胞内虾青素水平渐趋稳定,当NaNO_3浓度为0时细胞内虾青素含量显著高于其他试验组(P 0.05)。     

3-羟基丁酸对雨生红球藻PSⅡ光化学活性与色素合成的影响

利用试验生态学方法,研究3-羟基丁酸对雨生红球藻光系统Ⅱ（photosystem Ⅱ,PSⅡ）光化学活性与色素合成的影响。结果发现,3-羟基丁酸对雨生红球藻PSⅡ光反应中心造成胁迫损伤,细胞PSⅡ光化学最大光能转化效率（Fv/Fm）、有效光能转化效率（Yield）和表观电子传递速率（electron transfer rate,ETR）的参数均出现不同程度降低,其中0.02、0.10 μg/L 处理组的作用最明显;3-羟基丁酸造成雨生红球藻叶绿素a 含量波动变化并最终下降至较低水平;3-羟基丁酸能够促进雨生红球藻合成并积累虾青素,其中0.01 μg/L 浓度的促进作用最强,虾青素最高产量为7.57 mg/L;3-羟基丁酸影响了雨生红球藻自身资源在光合作用与抗逆合成之间的权衡分配。研究结果为使用3-羟基丁酸作为外源诱导物促进雨生红球藻生产虾青素提供了依据。     

雨生红球藻高产虾青素的培养条件优化

本研究从5种培养基中筛选出最适于雨生红球藻HP1藻株绿色细胞生长阶段细胞增殖的培养基,并针对筛选出的培养基分别进行有机碳源和无机碳源及其浓度的优化。在此基础上,以光照强度、初始p H值和诱导时间为实验因素,采用单因素试验、中心点复合设计(CCD)响应面法对雨生红球藻虾青素积累阶段的胁迫条件进行优化。结果表明:HP1藻株在配方A及OHM培养基中均能达到较高生物量,有机碳源和无机碳源的最优浓度均为0.5 g/L。HP1虾青素积累的最优胁迫条件为:光照145μmol/m~2·s,初始p H 7.0,诱导时间9 d。在上述条件下,以有机碳源(NaAC)和无机碳源(NaHCO_3)为碳源的培养体系中,虾青素产量最大分别为5.74 mg/L、4.25 mg/L。研究结果将为进一步提高雨生红球藻虾青素产量提供科学依据。     

茴香醚对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis LUGU)虾青素积累的影响

利用不同诱导条件促进雨生红球藻Haematococcus pluvialis积累虾青素已成为虾青素生产和研究的热点。实验研究了不同质量浓度的茴香醚(BHA)对胁迫培养条件下雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU生长和虾青素积累的影响。结果表明,2 mg/L的BHA能够显著提高虾青素的含量,最大含量可达29.03 mg/g,比对照组(14.30 mg/g)提高到2.03倍。而在相同的茴香醚诱导条件下,初始藻细胞的不同生长状态对细胞的生长及虾青素的合成也有很大的影响:处于对数生长期后期(14 d)的细胞更有利于虾青素的积累,其最大虾青素含量达到29.3 mg/g,分别比前期、中期和稳定期提高到2.9、1.01和1.72倍。实验表明茴香醚是虾青素诱导的有效诱导子,本研究也可为两阶段法诱导生产虾青素提供依据。     

外源乙烯利对雨生红球藻中虾青素积累的影响

本实验初步研究了一定浓度范围的乙烯利对雨生红球藻积累虾青素的影响。在对数生长期的藻液中分别加入一系列不同浓度的乙烯利溶液,然后转入胁迫培养(25℃,24h5000lux连续光照+营养盐饥饿),诱导细胞内虾青素的合成积累。在诱导过程中显微观察不同浓度乙烯利处理后细胞形态和色素积累的变化,并定期取样进行虾青素含量的测定。结果表明,添加0.05ml/L的乙烯利可以促进雨生红球藻积累虾青素,处理后的藻细胞比对照组的藻细胞提前17d完全变红,虾青素产量比对照提高了92.1%,达18.6mg/L藻液。另外还发现0.1ml/L的乙烯利对雨生红球藻积累虾青素有明显的抑制作用。高浓度的乙烯利(≥0.15ml/L)处理对雨生红球藻细胞存在致死作用。     

黄腐酸对Haematococcus pluvialis LUGU虾青素积累和lcy基因表达量的影响

雨生红球藻是虾青素的主要来源,为探明黄腐酸(FA)对雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU的影响,将不同质量浓度的FA添加至对数生长期的藻液中置于胁迫条件下培养,并分别对细胞生物量浓度、虾青素积累质量浓度以及番茄红素β-环化酶(lcy)基因表达量进行了测定。结果表明,黄腐酸质量浓度为10 mg/L,藻细胞的生物量产率达到最大80.28 mg/(L·d),比对照组提高5.44%;而虾青素最大质量浓度为20.82 mg/L,是在FA质量浓度为5 mg/L时测得,比对照组提高了86.89%。RT-PCR分析显示,虾青素合成的关键基因lcy的表达受FA的影响,当添加5 mg/L和10 mg/L的黄腐酸时lcy基因最大的表达量分别为对照的1.2倍和0.7倍。实验证明FA诱导下的雨生红球藻虾青素的积累含量和lcy基因表达量呈正相关。     

雨生红球藻物理破壁法提取虾青素研究

研究了几种常用的物理破壁法对雨生红球藻厚壁孢子细胞破壁率及虾青素提取率的影响,确定了高压均质处理、超声波法和反复冻融法的最适工艺条件。试验结果表明:高压均质处理最适合于雨生红球藻厚壁孢子的破碎和虾青素的提取。高压均质的优化条件为:40MPa,室温,循环3次,破壁率可达91.4%,虾青素提取率为28.02μg/mg(细胞干重),而未经破壁的虾青素提取率仅为17.92μg/mg(细胞干重),提取率提高了56.3%。     

雨生红球藻等离子诱变及高产藻株的筛选

目的通过等离子体诱变筛选获得高产虾青素的雨生红球藻突变株。方法将常压室温等离子体应(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)用于雨生红球藻的诱变育种处理。ARTP在常温下以输入功率100 W、处理距离2mm、气体流速10 L/min处理雨生红球藻40s,雨生红球藻的致死率达90%以上。在此条件下获得诱变株后,以虾青素合成抑制剂作为筛选剂,成功筛选获得一株虾青素高产藻株M45。结果该突变株的生物量和生长速率分别较出发株提高了6.45%和8.57%。突变株M45的虾青素含量达3.1%,较出发株提高了51.96%;虾青素产量为71.92 mg/L,相比于出发株提高了61.73%,且遗传稳定性实验表明,M45生产性能稳定。结论经等离子体诱变获得的突变株M45虾青素含量高,生产性能稳定,具有一定的工业应用前景,等离子体诱变方法适用于雨生红球藻的育种。     

黄腐酸对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis LUGU)虾青素积累的影响

通过形态学以及18S r RNA的分析,筛选鉴定出了一株新的雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU,并以其作为研究对象,研究了不同质量浓度的黄腐酸(FA)对胁迫培养条件下细胞生长和虾青素产量的影响。结果表明,5 mg/L和10 mg/L的FA不仅促进了藻细胞的生长(生物量浓度分别比对照组增加了4.26%和10.58%),而且能够显著提高虾青素的含量(最大含量分别达到20.82和12.23 mg/L)。其中,5 mg/L的FA诱导效果最为明显,虾青素产量(37.46 mg/g)比对照组(20.90 mg/g)提高79.23%。实验表明,黄腐酸在适当浓度下能够显著促进藻细胞内虾青素的积累,可作为一种有效的诱导子应用于虾青素的生产。     

硝氮质量浓度和温度在不同培养模式下对雨生红球藻生长的影响

探究了自养和异养条件下,硝氮质量浓度和生长温度对雨生红球藻生长的影响,以及自养胁迫阶段不同胁迫温度(30,35,38℃)对虾青素积累的影响。研究结果表明:雨生红球藻在异养条件下的最高生物量(3.319 g/L)远高于自养条件下最高生物量(0.687 g/L),生物量提高了84%。自养条件下虾青素最高质量分数为2.264%,异养条件下虾青素最高质量分数为3.199%,比自养条件下虾青素最高质量分数提高41.29%。异养生长具有明显的生长优势,此条件下最适碳源为乙酸钠质量浓度1.5 g/L,最适硝氮质量浓度浓度为0.5 g/L,最适生长温度为22℃,最佳胁迫温度为30℃。     

茴香醚对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis LUGU)虾青素积累和脂肪酸合成的影响

雨生红球藻虾青素积累过程与脂肪酸合成密切相关。实验研究了添加不同质量浓度的茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)对雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU,生物量浓度、虾青素积累量以及脂肪酸合成的影响。结果显示,在茴香醚质量浓度为2 mg/L,虾青素积累量显著提高,最大含量可达31.56mg/g,比对照组(15.42 mg/g)提高到2.05倍,此时藻细胞内总脂肪酸的含量也达到最大值(12.27%),比同时刻对照组的含量(6.22%)提高到1.97倍,单不饱和脂肪酸成分相比于对照组也产生了较大变化。脂肪酸合成关键基因acp、kas表达量也分别上调16.77、27.53倍。研究表明,适当浓度的BHA不仅能够显著提高虾青素合成,而且影响了脂肪酸总量和组成。     

高产虾青素的雨生红球藻胁迫条件和中试研究

探究雨生红球藻在不同培养条件和规模下积累虾青素的情况,结果表明在缺氮、光强6 000~8 000Lux、装液量100 m L/500 m L三角瓶的条件下虾青素含量可达藻细胞干重的(4.20±0.19)%,质量浓度为(59.23±2.13)mg/L。平板式光照生物反应器中试实验表明,绿色营养阶段在室内和半室外培养时,培养液中的生物量可达到0.88 g/L与1.04 g/L,进入稳定期前生产率分别为0.048 5 g/(L·d)和0.057 1 g/(L·d),红色胁迫阶段在半室外的培养条件下生物量可达到1.17 g/L,藻细胞中虾青素含量为1.49%,单位体积虾青素产量为17.49 mg/L,虾青素生产率为1.05 mg/(L·d)。     

运用雨生红球藻生产虾青素的研究进展

正雨生红球藻属于水生单细胞藻类物质,按照虾青素含量、形态以及颜色等,可将其分为后壁孢子、孢子、游动细胞与不动细胞四种。为提高雨生红球藻虾青素提取量,以雨生红球藻生产虾青素相关专利申请概况介绍为例,对运用雨生红球藻进行虾青素生产的研究进展展开解读,期望能够为雨生红球藻应用提供一些理论方面支持。     

褪黑素对雨生红球藻虾青素积累和脂肪酸合成的影响

以雨生红球藻H.pluvialis LUGU为对象,研究了不同浓度的褪黑素(MLT)对藻细胞生长、虾青素积累、脂肪酸及脂肪酸合成相关酶活性的影响。结果显示:10μmol/L MLT诱导条件下培养13 d藻细胞中虾青素含量可达26.62 mg/g,是对照组(12.3 mg/g)的2.16倍;培养5 d脂肪酸合成量(15.32%)最大,是对照组的1.24倍,同时提高了虾青素酯含量;MLT诱导条件下,脂肪酸合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性升高,而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性降低。研究表明,外源添加适当浓度的MLT不仅可以促进雨生红球藻中虾青素的积累,而且提高了脂肪酸的合成量,改变了脂肪酸组成。     

胁迫条件下褪黑素诱导雨生红球藻虾青素合成

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)在胁迫条件下可大量积累虾青素,已成为天然虾青素的主要来源。通过解析外源褪黑素(Melatonin,MLT)调控雨生红球藻在缺氮联合高光照胁迫条件下的防御效应,以期建立虾青素高效合成的技术体系。结果表明,胁迫条件下外源MLT的诱导显著促进了虾青素的积累,最高质量分数达到32.37 mg/g,较对照组增加了2.25倍。此外,外源MLT提高了胞内NO和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的含量,同时上调了虾青素合成关键酶基因dxs和chy的表达水平。研究表明,外源MLT诱导高光缺氮胁迫下雨生红球藻中虾青素的高效合成可能与MLT调控藻细胞内的NO、MAPK含量和虾青素合成关键酶基因dxs和chy的表达水平相关。     

雨生红球藻中虾青素含量快速测定方法

雨生红球藻中虾青素以虾青素单酯、二酯以及少量游离虾青素的形式存在,为了准确测定虾青素含量,通常需要将提取的虾青素酯水解转化为游离虾青素,再利用HPLC进行定量,操作耗时,不利于生产过程的快速监测。基于系统研究分光光度法直接测定细胞提取物中的混合虾青素含量和提取-酶解-HPLC法测定的关系,发现分光光度法估算的虾青素含量与HPLC法测定的准确含量之间具有良好的线性关系(r2=0. 997)。基于此建立了雨生红球藻虾青素快速测定方法,并对提取条件进行了优化。雨生红球藻粉(约5 mg)利用1 m L二甲基亚砜和6 m L丙酮进行1次提取,准确定容后,测定474 nm处的吸光度,根据吸光度与HPLC法虾青素含量间线性关系计算雨生红球藻中虾青素的含量。该方法操作简单,仅需10～20 min,测定准确,适于生产和流通环节的所需要的快速测定领域。