木瓜蛋白酶在亲和双水相系统中的分配行为及机制研究进展

本文查阅相关文献, 对木瓜蛋白酶传统提取方法(超滤法、盐析法、有机溶剂法、亲和层析法)及一些新兴的提取方法如双水相萃取法、亲和双水相法作了简要综述。利用金属螯合亲和双水相分配系统, 能有效获得高纯度木瓜蛋白酶, 但木瓜蛋白酶与亲和成相剂的相互作用及其分配行为与机制尚不清楚。研究木瓜蛋白酶与不同金属离子亲和成相剂之间的相互作用和吸附动力学模型;对酶的亲和结合物进行物理表征和分子模拟。阐明木瓜蛋白酶与不同金属离子亲和成相剂之间的亲和作用原理。将双水相萃取技术和亲和分配技术相融合, 提出基于木瓜蛋白酶的金属螯合亲和双水相分配技术, 该技术有望大力推动木瓜蛋白酶工业化高效制备的发展。     

木瓜蛋白酶在金属螯合亲和双水相中分配行为的研究

利用金属螯合双水相亲和分配技术对木瓜蛋白酶的萃取进行了研究。考察了不同无机盐和浓度、PEG的分子量和浓度、亲和配基的加入量、pH、酶添加量对木瓜蛋白酶分配的影响,对不含亲和配基的双水相和含亲和配基的双水相萃取木瓜蛋白酶的效果进行比较。优化的分配条件为:质量分数17%PEG 4 000,1%PEG-IDA-Cu~(2+),18%Na_2SO_4,pH 7.0,酶添加量为2 mg/g,在此条件下,木瓜蛋白酶的酶活性回收率可达到90%左右,蛋白分配比达到5.11。结果表明,PEG 4 000/Na_2SO_4系统比PEG 4 000/(NH_4)_2SO_4系统更有利于木瓜蛋白酶亲和分配;无机盐的浓度和亲和配基的加入量是影响木瓜蛋白酶分配的关键因素;与不含亲和配基的双水相系统相比,亲和配基的加入可以提高木瓜蛋白酶在PEG相的分配,酶活性回收率和蛋白分配比可分别提高10%和2.0左右,表明金属鳌合双水相分配技术分离木瓜蛋白酶是可行的,为该体系的放大试验或规模化生产奠定了相应的试验基础。     

藻蓝蛋白分离纯化技术及其影响因素分析

文中概述了藻蓝蛋白近年来分离纯化技术的研究方法及其应用情况,包括多步盐析法、双水相萃取法、盐析结合双水相萃取法、反胶团萃取法、壳聚糖亲和沉淀-活性炭吸附-DEAE Sephadex A-25柱层析法、离子交换色谱与疏水间相互作用色谱结合法,总结了影响藻蓝蛋白分离纯化的因素,分析了藻蓝蛋白分离提纯技术的现有问题并提出了相应对策,还对藻蓝蛋白的应用前景进行了展望。     

木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe~(3+)/(NH_4)_2SO_4双水相体系中亲和分配行为研究

目的:研究木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+/(NH4)2SO4亲和双水相体系中分配行为。方法:采用浊点法,构建双水相相图,考察各成相剂对木瓜蛋白酶活性的影响;研究不同PEG4000和(NH4)2SO4的质量分数、不同PEG-IDA-Fe3+的取代量时,木瓜蛋白酶在两相体系中分配行为的变化;用响应面法优化亲和双水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分离条件;同时对木瓜蛋白酶在萃取体系中的结构进行表征。结果:当两相体系中p H6.9,PEG4000质量分数16%,(NH4)2SO4质量分数20%,PEG-IDA-Fe3+为3%时,木瓜蛋白酶的上相酶活性回收率达90.5%,蛋白分配系数达1.85,而其在PEG/(NH4)2SO4中的酶活回收率及蛋白分配系数都低于PEG-IDA-Fe3+/(NH4)2SO4亲和双水相体系。结论:PEG-IDA-Fe3+/(NH4)2SO亲和双水相系统能有效提高木瓜蛋白酶的分配效果,采用Fe3+螯合PEG成相剂的双水相萃取木瓜蛋白酶条件温和,不影响酶的特征结构。     

双水相亲和萃取法从豆壳中分离过氧化物酶

采用双水相金属螯合亲和萃取法从豆壳中分离过氧化物酶,考察了豆壳过氧化物酶在不同类型双水相系统中金属螯合亲和配基聚乙二醇(PEG)-亚氨基二乙酸(IDA)-Cu(Ⅱ)对亲和分配的影响,发现PEG/羟丙基淀粉(PES)系统适合于金属螯合亲和分配豆壳过氧化物酶。进一步考察亲和配基加入量、成相聚合物分子量、系统组成、pH等因素对PEG/PES系统亲和分配的影响,优化分离条件为:PEG20009%,PES20014%,PEG-IDA-Cu(Ⅱ)1%,豆壳过氧化物酶的分配系数达40,纯化因子为2.8,回收率达到93%。     

对乳酸发酵中反馈抑制消除方法的探讨

本文介绍了目前国外所研究的乳酸发酵消除产物抑制的各种新型分离方法，主要为：有机溶剂的液－液萃取法、乳状液膜萃取法、双水相萃取法、膜循环反应器法和离子交换树脂法。分析了各种方法消除产物抑制的原理，并探讨了各自所存在的优缺点及与工业化的距离。     

辛巴蓝F3GA-羟丙基淀粉的制备及其对蛋白质的亲和分离特性

为了开发新型的淀粉基生物分离材料,制备了适用于亲和双水相萃取技术的辛巴蓝F3GA-羟丙基淀粉,并考察了其对蛋白的亲和分离特性。将三嗪类染料辛巴蓝F3GA分别偶联于不同取代度的羟丙基淀粉上,对其反应时间、温度以及pH进行考察,根据亲和配基密度,得到制备亲和分离材料的优化工艺条件为:反应温度60℃,反应时间6 h,pH 9.5。进一步考察了亲水性基团、亲和配基对羟丙基淀粉亲和材料/聚乙二醇双水相体系液液平衡的影响,表明,亲和配基的引入对系统的相平衡影响很小,系统结线都基本重合,斜率变化很小;随着羟丙基淀粉取代度的增大,双水相呈相区域向右移。牛血清白蛋白被分配到羟丙基淀粉亲和材料相中,当亲和配基密度达到1.25μmol/g时,分配效率从30%提高到80%以上。     

双水相萃取技术的研究进展及应用

介绍了双水相萃取技术(ATPE)的应用现状,综述了近年来双水相萃取技术的相关研究进展。针对双水相系统(ATPS)的经济适用性问题,对新型ATPS相组成材料的研究取得了极大的发展;为了提高双水相萃取技术的选择性和分离效率,在组成传统ATPS的聚合物上偶联亲和配基的亲和ATPS也得到关注;双水相萃取技术的发展趋势还体现在与其他生物分离技术的结合以及萃取机理和热力学模型的优化上。     

PEG/(NH4)2SO4双水相相平衡数据的关联及木瓜蛋白酶在该体系中分配模型的建立

为了研究木瓜蛋白酶在双水相中的分配行为,用浊点法测定了聚乙二醇(2000、4000、6000)/硫酸铵双水相体系在298.15K下的双节线和液液相平衡数据,采用Merchuk方程、Othmer-Tobisa方程和Bancroft方程对双节线数据、液液相平衡数据进行了关联,并建立了木瓜蛋白酶在PEG/(NH4)2SO4双水相体系中的分配模型。通过相关系数考察双水相各组分浓度与分配系数的相关度,得到分配系数的对数与上下相组分的浓度差相关度较高,提出了木瓜蛋白酶分配系数与双水相成相组分浓度差的经验关系式,木瓜蛋白酶分配系数的计算值与实验值之间的相对偏差小于10%且小于其他同类模型,表明实验建立的模型对木瓜蛋白酶在聚乙二醇(2000、4000、6000)/硫酸铵双水相体系中关联效果较好,可用于木瓜蛋白酶分配系数的计算,为双水相体系中木瓜蛋白酶酶活分配系数的工程计算和双水相萃取过程的设计提供参考。     

双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究

对以PEG(聚乙二醇)/(NH4)2SO4为双水相系统提取的木瓜蛋白酶进行了研究。实验考察了不同分子量PEG对木瓜蛋白酶活性的影响以及PEG浓度、(NH4)2SO4浓度、pH和温度对木瓜蛋白酶分配系数的影响。结果表明:双水相体系最佳条件为PEG60027%,(NH4)2SO421%,pH7·0和温度60℃。在上述条件下,木瓜蛋白酶的分配系数可达9·28。     

中药挥发油提取技术研究进展

综述了近年中药挥发油提取技术的研究进展,主要包括水蒸气蒸馏法、压榨法、溶剂提取法等传统的提取方法和微波提取法、超临界二氧化碳提取法、固相微提取法、超声波提取法、分子蒸馏、酶法提取、微胶囊双水相提取法等新提取方法及研究成果。     

盐析法联合离子液体双水相纯化木瓜蛋白酶

本实验以海南产番木瓜为研究对象,采取盐析法联合离子液体双水相对其富含的木瓜蛋白酶进行提取纯化。以不同饱和度的(NH4)2SO4对粗酶液进行盐析,通过实验结果分析,确定了以饱和度分别为20%和45%的两步盐析法的最佳条件。然后再进行双水相萃取,通过单因素试验结果设计3因素3水平的响应面试验,优化双水相萃取条件为离子液体[C4mim]N(CN)2质量分数29.76%、(NH4)2SO4质量分数16.08%、pH?8.18,在此最优条件下木瓜蛋白酶萃取率为89.01%,酶活力回收率为86.72%,所得到木瓜蛋白酶比活力为1?056?U/mg,纯化倍数达到9.6?倍。然后对实验产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,经纯化的酶中杂条带明显减少,验证了分离纯化的效果。     

新型提取技术在发酵产物分离中的应用

目的对发酵产物分离中双水相、相转变、反微团、超临界、浮选络合提取等的应用作一综述。方法根据近年的文献,归纳总结新型提取方法的应用范围及特点。结果与结论新型提取方法是对传统提取方法的补充与改进,条件温和,环保高效,适合分离与提纯生物活性物质,在发酵工业中有着广阔的应用前景。     

双水相萃取茶叶中茶多酚

考察了双水相萃取茶叶中茶多酚的可能性及影响因素,结果表明,以乙醇/磷酸氢二钾为双水相萃取体系,当磷酸氢二钾的质量分数为0.33 g/mL,乙醇的体积分数为80%,萃取时间20 min时,茶多酚的萃取率达到92.1%。乙醇/磷酸氢二钾双水相体系对于茶叶中茶多酚的萃取分离提供了新方法。     

天花粉蛋白的盐析工艺和亲和双水相分离工艺

近年,随着天花粉蛋白(TCS)在抗癌细胞和HIV病毒方面的临床性研究进展,天花粉蛋白生产工艺也需在保证效益的前提下精细化。本实验利用硫酸铵分级沉淀、硫酸铵粗提后亲和双水相进一步纯化,得到精制的天花粉蛋白。并对提取工艺进行了优化,最后利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对其纯度进行了鉴定以及相对分子质量的测定,并对比了盐析法和亲和双水相分离法,研究结果表明:硫酸铵沉淀法最佳分离条件为固液比为1∶12、浸泡时间为24h、pH在5左右,最终得率0.8mg/g;亲和萃取最佳条件:染料CibacronBlue F3GA-吐温80在成相吐温80中的含量8%,成相吐温80的占双水相含量为4.0%,(NH4)2SO4的含量2.0mol/L,充分混合的时间9h,反萃取氯化钠的含量为0.5mol/L,反萃取的时间为8h,得率0.6mg/g,但凝胶电泳显示其纯度较高。     

金银花叶中绿原酸的提取及抗氧化活性研究

本研究利用双水相体系分离金银花叶中的绿原酸并分析其抗氧化活性。探讨4种乙醇/无机盐双水相体系提取绿原酸的能力,在乙醇浓度、盐浓度、提取时间和温度4个单因素实验的基础上,通过响应面法研究NaH₂PO₄添加量、乙醇浓度和提取时间3因素及其交互作用对绿原酸提取率的影响。研究结果显示,4种乙醇/无机盐双水相体系中,乙醇/NaH₂PO₄双水相体系具有最佳的绿原酸提取效果。优化的提取工艺为NaH₂PO₄添加量3.15 g、乙醇浓度28.5%和提取时间49 min,提取率可达80.2%。当金银花叶绿原酸浓度为0.5 mg/mL时,其DPPH自由基清除率达84.2%;绿原酸浓度为1 mg/mL时,脂肪过氧化抑制能力达88%。这些研究结果表明乙醇/NaH₂PO₄双水相体系能有效提取金银花叶中的绿原酸,具有较好的应用前景。     

盐析和双水相萃取法纯化细菌木聚糖酶的比较

通过对比硫酸铵盐析和双水相萃取两种木聚糖酶初级纯化方法的纯化效率,确定更加适于Paenibacillus sp.B1709木聚糖酶初级纯化的方法。结果显示,双水相萃取较盐析具有更好的木聚糖酶纯化回收效果,并对其主要实验参数进行优化,得出双水相萃取最佳条件为:聚乙二醇(PEG)4000 Da,浓度22%,最佳成相盐(NH₄)₂SO₄,最适浓度18%,最适pH6.0,NaCl 2%。在此条件下,可实现分配系数9.90,酶活力回收率为90.84%,纯化倍数6.13。实验结果显示双水相萃取相较于盐析在大规模纯化尤其针对复杂纯化目标时具备一定技术的优势。