黄腐酸对Haematococcus pluvialis LUGU虾青素积累和lcy基因表达量的影响

雨生红球藻是虾青素的主要来源,为探明黄腐酸(FA)对雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU的影响,将不同质量浓度的FA添加至对数生长期的藻液中置于胁迫条件下培养,并分别对细胞生物量浓度、虾青素积累质量浓度以及番茄红素β-环化酶(lcy)基因表达量进行了测定。结果表明,黄腐酸质量浓度为10 mg/L,藻细胞的生物量产率达到最大80.28 mg/(L·d),比对照组提高5.44%;而虾青素最大质量浓度为20.82 mg/L,是在FA质量浓度为5 mg/L时测得,比对照组提高了86.89%。RT-PCR分析显示,虾青素合成的关键基因lcy的表达受FA的影响,当添加5 mg/L和10 mg/L的黄腐酸时lcy基因最大的表达量分别为对照的1.2倍和0.7倍。实验证明FA诱导下的雨生红球藻虾青素的积累含量和lcy基因表达量呈正相关。     

雨生红球藻虾青素积累条件优化研究

虾青素具有很强的抗氧化能力,雨生红球藻在目前已知生物中虾青素含量最高。该文采用响应面法研究温度、pH值、NaCl浓度、钨酸钠浓度对雨生红球藻虾青素积累的影响。结果表明,雨生红球藻虾青素积累的最佳工艺条件为温度27℃、pH 9.6、NaCl浓度1.7 g/L、钨酸钠浓度5.2 mmol/L。各因素对雨生红球藻虾青素积累影响的顺序为pH值＞温度＞钨酸钠浓度＞NaCl浓度。     

光照、氮素和高盐胁迫对雨生红球藻积累虾青素的影响研究

为摸索雨生红球藻积累虾青素的最优条件,研究光照强度、NaNO_3和NaCl浓度对雨生红球藻光合作用和积累虾青素的影响,结果表明:不同光照强度处理组最大光能转化效率(Fv/Fm)较对照组均显著降低(P 0.05);试验第24天,光照强度为236μmol/m~2/s的试验组微藻积累虾青素达最高值9.01 mg/L;NaCl浓度为10 g/L和12.5 g/L时雨生红球藻Fv/Fm和有效光能转化效率值(Yield)均低于对照组,而NaCl浓度为5 g/L时微藻Fv/Fm和Yield值均高于对照组,NaCl浓度为5、7.5、10 g/L时微藻积累虾青素水平显著高于其他试验组(P 0.05),试验第24天,NaCl浓度为7.5 g/L时,微藻积累虾青素含量达到最高,较对照组提高了34.4%;NaNO_3浓度为0、0.032、0.065 g/L时,雨生红球藻Fv/Fm整体呈先上升后缓慢降低的趋势,较对照组差异显著(P 0.05),在氮胁迫处理条件下雨生红球藻积累虾青素含量逐渐升高,试验第22天后细胞内虾青素水平渐趋稳定,当NaNO_3浓度为0时细胞内虾青素含量显著高于其他试验组(P 0.05)。     

茴香醚对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis LUGU)虾青素积累的影响

利用不同诱导条件促进雨生红球藻Haematococcus pluvialis积累虾青素已成为虾青素生产和研究的热点。实验研究了不同质量浓度的茴香醚(BHA)对胁迫培养条件下雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU生长和虾青素积累的影响。结果表明,2 mg/L的BHA能够显著提高虾青素的含量,最大含量可达29.03 mg/g,比对照组(14.30 mg/g)提高到2.03倍。而在相同的茴香醚诱导条件下,初始藻细胞的不同生长状态对细胞的生长及虾青素的合成也有很大的影响:处于对数生长期后期(14 d)的细胞更有利于虾青素的积累,其最大虾青素含量达到29.3 mg/g,分别比前期、中期和稳定期提高到2.9、1.01和1.72倍。实验表明茴香醚是虾青素诱导的有效诱导子,本研究也可为两阶段法诱导生产虾青素提供依据。     

不同温度下雨生红球藻优良藻株筛选

为获得适宜大规模培养的藻株,研究和比较了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)3个不同品系分别在15、20、25、30℃中的生长和虾青素积累情况。结果表明,温度对雨生红球藻的生长和虾青素积累有显著的影响,并且与藻种品系有关。各培养温度下,雨生红球藻藻株H3的细胞密度、藻细胞干重、虾青素含量和产量具有明显优势。藻株H3的最适生长温度为15℃,其最终细胞密度和细胞干重分别为11.75×10~4 cell/mL和0.337 g/L,但该条件不利于虾青素的积累;虾青素积累在20℃培养时最高,其虾青素含量和产量分别为1.15%、3.41 mg/L;而在30℃时生物量和虾青素产量均最低。因此,优先选择H3作为大规模培养的藻种。     

褪黑素对雨生红球藻虾青素积累和脂肪酸合成的影响

以雨生红球藻H.pluvialis LUGU为对象,研究了不同浓度的褪黑素(MLT)对藻细胞生长、虾青素积累、脂肪酸及脂肪酸合成相关酶活性的影响。结果显示:10μmol/L MLT诱导条件下培养13 d藻细胞中虾青素含量可达26.62 mg/g,是对照组(12.3 mg/g)的2.16倍;培养5 d脂肪酸合成量(15.32%)最大,是对照组的1.24倍,同时提高了虾青素酯含量;MLT诱导条件下,脂肪酸合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性升高,而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性降低。研究表明,外源添加适当浓度的MLT不仅可以促进雨生红球藻中虾青素的积累,而且提高了脂肪酸的合成量,改变了脂肪酸组成。     

3-羟基丁酸对雨生红球藻PSⅡ光化学活性与色素合成的影响

利用试验生态学方法,研究3-羟基丁酸对雨生红球藻光系统Ⅱ（photosystem Ⅱ,PSⅡ）光化学活性与色素合成的影响。结果发现,3-羟基丁酸对雨生红球藻PSⅡ光反应中心造成胁迫损伤,细胞PSⅡ光化学最大光能转化效率（Fv/Fm）、有效光能转化效率（Yield）和表观电子传递速率（electron transfer rate,ETR）的参数均出现不同程度降低,其中0.02、0.10 μg/L 处理组的作用最明显;3-羟基丁酸造成雨生红球藻叶绿素a 含量波动变化并最终下降至较低水平;3-羟基丁酸能够促进雨生红球藻合成并积累虾青素,其中0.01 μg/L 浓度的促进作用最强,虾青素最高产量为7.57 mg/L;3-羟基丁酸影响了雨生红球藻自身资源在光合作用与抗逆合成之间的权衡分配。研究结果为使用3-羟基丁酸作为外源诱导物促进雨生红球藻生产虾青素提供了依据。     

雨生红球藻高产虾青素的培养条件优化

本研究从5种培养基中筛选出最适于雨生红球藻HP1藻株绿色细胞生长阶段细胞增殖的培养基,并针对筛选出的培养基分别进行有机碳源和无机碳源及其浓度的优化。在此基础上,以光照强度、初始p H值和诱导时间为实验因素,采用单因素试验、中心点复合设计(CCD)响应面法对雨生红球藻虾青素积累阶段的胁迫条件进行优化。结果表明:HP1藻株在配方A及OHM培养基中均能达到较高生物量,有机碳源和无机碳源的最优浓度均为0.5 g/L。HP1虾青素积累的最优胁迫条件为:光照145μmol/m~2·s,初始p H 7.0,诱导时间9 d。在上述条件下,以有机碳源(NaAC)和无机碳源(NaHCO_3)为碳源的培养体系中,虾青素产量最大分别为5.74 mg/L、4.25 mg/L。研究结果将为进一步提高雨生红球藻虾青素产量提供科学依据。     

雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨

探讨了雨生红球藻(Haematoccuspluvialis)712株的适宜培养条件及藻体诱导累积虾青素的培养基条件。重点研究了温度、pH和光照条件对雨生红球藻营养生长的影响,以及NaNO3、Fe2+盐和乙酸钠浓度对雨生红球藻诱导累积虾青素含量的影响。结果表明:24℃、1000～1500lx连续光照、pH8.0左右的生长条件适合雨生红球藻游动细胞增殖,使平均生长速率达到0.252/d。通过正交试验表明:缺氮培养基对于雨生红球藻细胞累积虾青素最为有利,虾青素含量达到6.72μg/mL,而FeSO4和乙酸钠浓度对虾青素的累积无显著性影响。     

光照强度对雨生红球藻细胞生长和虾青素积累的影响

初步研究了不同光照强度(40~200μmol/m2·s)对雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)细胞生长及虾青素积累的影响。结果表明,雨生红球藻在培养初期细胞干物质积累较少,虾青素含量较低;而在整个培养后期细胞干物质积累较多,虾青素含量较高。细胞生长进入对数生长期的时间随光照强度增加而减少。中等光照强度条件(80μmol/m2·s)最适于藻细胞生长,该条件不利于虾青素的积累;而高光强条件(200μmol/m2·s)明显抑制藻细胞生长(P<0.05),但虾青素含量明显提高(P<0.05);继续增加光照强度(240μmol/m2·s),单个细胞中的虾青素含量显著增加。     

叔丁基对羟基茴香醚对雨生红球藻虾青素积累和psy基因表达量的影响

研究胁迫培养条件下,在对数生长期的雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU藻液中添加不同质量浓度叔丁基对羟基茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)对其影响,并分别对细胞生物量、虾青素积累量以及八番茄红素合成酶psy基因表达量进行了测定。结果表明,BHA质量浓度为2 mg/L时,虾青素积累量显著提高,最大含量可达29.03 mg/g,是对照组(14.30 mg/g)的2.03倍。而在相同的BHA诱导条件下,初始藻细胞的不同生长状态对细胞生长及虾青素合成也有很大影响:处于对数后期(14 d)的细胞其最大虾青素含量可达29.3 mg/g,分别是对数前期、中期和稳定期的2.93、1.01倍和1.73倍。实时荧光定量聚合酶链式反应分析显示,虾青素合成关键基因psy的表达受BHA的影响,当对数后期(14 d)添加2 mg/L BHA时,psy基因相对表达水平为对照9.2倍。结果表明,适当质量浓度BHA不仅能够显著提高虾青素合成关键酶基因psy的表达水平,并且明显促进了微藻细胞内虾青素积累量,为虾青素产业化提供了一种有效的策略。     

Simultaneous measurement of chlorophyll and astaxanthin in Haematococcus pluvialis cells by first-order derivative ultraviolet-visible spectrophotometry

A first-order derivative spectrophotometric method has been developed for the simultaneous measurement of chlorophyll and astaxanthin concentrations in Haematococcus pluvialis cells. Acetone was selected for the extraction of pigments because of its good sensitivity and low toxicity compared with other organic solvents tested; the tested solvents included acetone, methanol, hexane, chloroform, n-propanol, and acetonitrile. A first-order derivative spectrophotometric method was used to eliminate the effects of the overlaping of the chlorophyll and astaxanthin peaks. The linear ranges in 1D evaluation were from 0.50 to 20.0 microg x ml(-1) for chlorophyll and from 1.00 to 12.0 microg x ml(-1) for astaxanthin. The limits of detection of the analytical procedure were found to be 0.35 microg x ml(-1) for chlorophyll and 0.25 microg x ml(-1) for astaxanthin. The relative standard deviations for the determination of 7.0 microg x ml(-1) chlorophyll and 5.0 microg x ml(-1) astaxanthin were 1.2% and 1.1%, respectively. The procedure was found to be simple, rapid, and reliable. This method was successfully applied to the determination of chlorophyll and astaxanthin concentrations in H. pluvialis cells. A good agreement was achieved between the results obtained by the proposed method and HPLC method.     

雨生红球藻等离子诱变及高产藻株的筛选

目的通过等离子体诱变筛选获得高产虾青素的雨生红球藻突变株。方法将常压室温等离子体应(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)用于雨生红球藻的诱变育种处理。ARTP在常温下以输入功率100 W、处理距离2mm、气体流速10 L/min处理雨生红球藻40s,雨生红球藻的致死率达90%以上。在此条件下获得诱变株后,以虾青素合成抑制剂作为筛选剂,成功筛选获得一株虾青素高产藻株M45。结果该突变株的生物量和生长速率分别较出发株提高了6.45%和8.57%。突变株M45的虾青素含量达3.1%,较出发株提高了51.96%;虾青素产量为71.92 mg/L,相比于出发株提高了61.73%,且遗传稳定性实验表明,M45生产性能稳定。结论经等离子体诱变获得的突变株M45虾青素含量高,生产性能稳定,具有一定的工业应用前景,等离子体诱变方法适用于雨生红球藻的育种。     

营养强化混养条件下提高色绿藻生物量和虾青素产量

本研究在混养条件下,系统地比较了葡萄糖浓度、氮源种类以及不同碳氮比对色绿藻生物量和虾青素产率的作用规律。目的是在短时间内达到最高生物量同时获得较高含量的虾青素,为建立色绿藻高密度快速扩种和诱导积累虾青素应用技术提供科学依据。研究结果表明:在混养条件下,当葡萄糖浓度一定时,硝酸钠是细胞生长所需的最优氮源,6 d可达到最高生物量浓度9.23 g/L,平均比生长速率为0.24/d,虾青素产量为12.38 mg/L,虾青素占总类胡萝卜素的比例高达46.94%。至于不同碳氮比、葡萄糖浓度对色绿藻生物量和虾青素生产的影响,当葡萄糖浓度为30 g/L、C/N比为34为细胞生长的最优条件,生物量浓度最高为11.28 g/L,平均比生长速率高达0.32/d;虾青素含量显著优于其他组(p0.05),虾青素的产量为21.77 mg/L,虾青素占总类胡萝卜素的比例进一步提高到52.71%。本研究结果对于色绿藻高密度快速生长并积累大量虾青素的放大技术开发具有重要的指导意义。     

雨生红球藻对戚风蛋糕品质的影响及其虾青素稳定性

为提高戚风蛋糕的营养价值和烘焙品质，本研究将雨生红球藻添加至戚风蛋糕中。采用高效液相色谱仪和气相色谱仪等对雨生红球藻营养成分进行测定，利用全自动色差仪、质构仪等探索不同添加量雨生红球藻对戚风蛋糕色泽和质构等的影响，并探讨了戚风蛋糕抗氧化活性及烘焙对雨生红球藻中虾青素的影响。结果表明:本批次雨生红球藻中虾青素含量为20.93±0.41 mg/g DCW，总糖、蛋白质和脂肪酸含量分别为25.56%±0.94%、19.97%±0.13%和27.11%±0.25%。雨生红球藻的添加改善了戚风蛋糕的色泽，使其呈现橙红色，使戚风蛋糕的硬度、弹性和咀嚼性逐渐增大，抗氧化活性逐渐增强，蛋糕比容在添加量为2.0%时达到最大。当藻粉添加量为4.0%时，蛋糕对DPPH和羟基自由基的清除率比对照组分别提高了119.92%和9.17%。焙烤后虾青素含量显著降低，损失率达到49.37%~62.17%。并且随着添加量的增加，蛋糕出现了一定的藻腥味，影响了蛋糕的风味。因此，雨生红球藻适宜添加量为1.0%~2.0%，不仅改善了戚风蛋糕的品质也提升了其营养价值。     

可切换亲水溶剂提取虾青素及其纳米粒抗氧化性探究

采用单因素以及正交试验优化了可切换亲水溶剂N-N二甲基环己胺(DMCHA)从雨生红球藻中提取虾青素的工艺,并将虾青素使用酰化羧甲基壳聚糖自聚体进行纳米包埋,探究虾青素纳米自聚体的抗氧化性。结果表明,在提取温度35℃,提取时间24 h,提取料液比1:20 g/mL条件下,虾青素提取率最高,达到氯仿甲醇提取的总虾青素含量的85.48%,虾青素纳米自聚体的虾青素载量可达到392 μg/mL。抗氧化性实验证明,在不同pH变化下,虾青素纳米自聚体比虾青素溶液更加稳定;55℃放置24 h条件下,虾青素纳米自聚体羟基自由基清除率仍可保持在40%,证明虾青素纳米自聚体可以有效维持虾青素的氧化稳定。     

混合培养对雨生血球藻虾青素产量的影响

研究了不同光照强度及添加不同葡萄糖量进行混合培养对雨生血球藻虾青素产量的影响.研究表明,单位体积培养液虾青素产量因光照强度和葡萄糖添加量不同而不同,在光照强度为2500lx以及葡萄糖添加量为3g/L时,虾青素产量最高.光照强度和葡萄糖添加浓度对虾青素产量具有交互影响.通过中心组合试验,确定混合培养条件下达到最高虾青素产量所需要的葡萄糖添加量及光照强度分别为3.1616g/L和2605.66lx.此时的虾青素产量为41.06mg/L,是自养培养时的2.02倍.     

雨生红球藻转化条件及虾青素积累的研究

在单因素试验基础上,选择转化光照强度、转化温度和转化时间为自变量,虾青素含量为响应值,利用Box-Behnken实验和响应面分析法,对转化条件进行优化。结果表明,在温度29.92℃,pH值10,光照7203.95lx的条件下转化10.6d,虾青素含量可达（33.796±1.556）mg/L,与未优化转化条件时相比,提高了0.99倍。     

Enlarged and astaxanthin-accumulating cyst cells of the green alga Haematococcus pluvialis

The cyst cells of Haematococcus pluvialis were separated into fractions of relatively uniform size by sucrose density gradient centrifugation. The fraction at the bottom of the centrifuge tube with the largest specific gravity from density gradients of mature cysts mainly consisted of enlarged, red cyst cells and had the highest astaxanthin content. To examine the relationship between cell size and astaxanthin content of cysts, formation of the fluorescent dichlorofluorescein (DCF) from 2',7'-dichlorohydrofluorescein diacetate of cyst cells in each fraction from density-gradient centrifugation under oxidative stress caused by methyl viologen (1.0 mM) was studied. The formation of DCF in cyst cells was decreased with larger cell diameter. This decrease was also correlated with increases in astaxanthin content. Therefore, both cell diameter and the fluorescent DCF content of cyst cells would be good parameter to select astaxanthin-hyperproducing strains from native populations of H. pluvialis.     

Effective utilization of transmitted light for astaxanthin production by Haematococcus pluvialis

A new cultivation method, in which physiological responses of Haematococcus pluvialis to different intensities and wavelengths of illuminating light are utilized, is proposed. In this method, light transmitted through a cultivation vessel illuminated from the opposite side was utilized for the early-phase cultivation of H. pluvialis in another inoculated vessel that was located behind the cultivation vessel, to save time required for the growth of cells. After harvesting cells from the front vessel, the vessel that was originally behind was shifted to the position of the front vessel. The abrupt increase in light intensity caused by shift of the position induced the effective accumulation of astaxanthin. These procedures for inoculation, shift of vessels and harvest were repeated using two vessels arranged in series along the light path. After four repeated cycles of cultivation (840 h from the start of cultivation), using 2.5 cm thick vessels, astaxanthin production per unit volume and the astaxanthin content were higher than obtained in a batch cultivation with two 2.5 cm vessels.