辐射基因治疗黑色素瘤的实验研究

研究低剂量辐射结合腺病毒(AdCMV)载体介导的p53基因转导对人黑色素瘤A375细胞系基因转移效率和辐射敏感性的影响.用复制缺陷的重组腺病毒载体(AdCMV-p53)介导入p53基因转染1 Gy X-射线预辐照的A375细胞系,RT-PCR检测mRNA水平,流式细胞仪测定细胞周期阻滞及外源性P53蛋白表达情况,克隆形成率测定辐射后细胞存活率.用携带报道基因的复制缺陷重组腺病毒载体AdCMV-GFP作为对照.实验结果表明,1 Gy X-射线辐照可较高地增加AdCMV-p53对A375细胞的基因转导效率,转导的外源性野生型p53可在A375(wtp53)细胞中高效表达,并诱导细胞周期G1期阻滞;单纯转导p53对A375细胞无明显诱导凋亡和生长抑制效应;而转导p53后给予X-射线辐射,当剂量达到4 Gy及其以上时,48h后AdCMV-p53感染组细胞开始出现明显形态改变,克隆存活率明显低于AdCMV-GFP感染组和未感染组,显示存活曲线下移,4Gy时细胞存活率就减少了1个量级.小剂量辐射既可有效增加AdCMV-p53介导的p53转导,又不会对患者产生明显副作用;转导野生型p53的人黑色素瘤A375细胞系显示P53过表达;过表达的P53蛋白虽然对A375细胞无明显生长抑制及凋亡诱导作用,但可明显增加其辐射敏感性.这表明p53是基因治疗黑色素瘤较好的侯选基因,也为临床上放疗联合基因治疗黑色素瘤提供了实验室依据,即减轻临床上对于辐射敏感性差的肿瘤单纯大剂量照射或单纯基因疗法中rAd-p53制品用量过大而给病人造成的毒副作用.     

不同LET辐射对HepG2肝癌细胞的辐射敏感性与周期阻滞的影响

本工作研究不同LET射线辐照对HepG2肝癌细胞辐射敏感性、周期进程和凋亡的影响,为重离子治疗癌症的临床应用积累基础数据.以0、0.5、1、2、4、8Gy剂量的12C6 离子及X射线分别照射处于指数生长期的HepG2细胞,用克隆形成率测定细胞辐射敏感性,通过流式细胞术测定细胞DNA含量以确定各时相细胞的比例及细胞凋亡情况.实验结果显示,12C6 离子辐照所致的HepG2细胞存活率明显低于X射线.随着吸收剂量的增加和修复时间的延长,12C6 离子能导致更显著的细胞S期阻滞、G2/M期阻滞延迟和细胞凋亡.说明与X射线相比,12C6 离子辐照能更有效地杀伤HepG2肝癌细胞并诱导其凋亡.     

X射线辐照诱导人神经胶质瘤细胞DNA双链损伤研究

采用免疫荧光染色法检测X射线诱导M059K细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)和磷酸化的毛细血管扩张性共济失调症突变基因(pATM)焦点的形成;流式细胞仪分析M059K细胞γH2AX和pATM表达的周期依赖性。免疫荧光染色检测结果显示,γH2AX和pATM焦点阳性细胞分别以照射后0.5、4 h表达最高,照射后24h,高剂量组焦点阳性细胞达100%。流式细胞仪分析结果显示,γH2AX和pATM的表达具有细胞周期依赖性。照射后0.5、4 h,γH2AX和pATM在细胞各期的表达均明显增加,并以G0/G1期为著;照射后24 h,γH2AX和pATM在G0/G1和S期表达降低,而G2/M期细胞表达明显增加。细胞呈现明显的G2/M期阻滞。结果提示,γH2AX和ATM信号通路参与X射线诱导的M059K细胞DNA双链断裂。     

125I籽源持续低剂量率照射诱导人肺癌细胞的旁效应

观察125I籽源持续低剂量率照射诱导人肺癌细胞损伤的旁效应.选择对高剂量率外照射敏感性不同的A549人肺腺癌细胞和NCI-H446人小细胞肺癌细胞,采用125I籽源离体照射细胞模式,将直接受照细胞与未受照细胞共培养24h,应用CB微核法和γH2AX荧光免疫分析法,检测2Gy和4Gy125I籽源持续低剂量率照射诱导人肺癌细胞的微核形成和DNA双链断裂水平.结果表明,125I籽源照射能显著诱导A549和NCI-H446细胞的微核形成率和γH2AX位点形成率增加的旁效应,显示增强对肿瘤细胞的杀伤作用.旁效应强弱与累积照射剂量、肿瘤细胞的辐射敏感性相关:对高剂量率外照射敏感的NCI-H446细胞对低剂量率照射及其旁效应的敏感性高于A549细胞,但与直接辐射效应相比,125I籽源照射诱导A549细胞旁效应高于NCI-H446细胞,这两种细胞的辐射旁效应均随累积照射剂量增加而降低,提示介导旁效应的信号因子水平可能随细胞损伤程度的增加而下降.     

三株肿瘤细胞对X射线辐射敏感性的比较

比较研究X射线对人子宫颈癌细胞(He La)、人肝癌细胞(Hep G2)和人粘液表皮样癌细胞(MEC-1)的辐射敏感性。X射线照射三株细胞至吸收剂量2、4、6、8 Gy后0.5、4和24 h,用克隆形成实验测定细胞增殖,中性彗星电泳法检测DNA双链损伤(DNA double strand breaks,DSB),免疫荧光染色法检测磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)焦点的形成。结果显示:2、4、6、8 Gy剂量组及照射后不同时间点均以Hela细胞的存活分数(Survival fraction,SF)最高;CASP软件分析显示,DSB增加呈现时间和剂量依赖关系,照射后4 h尾矩(Tail moment,TM)增加最为明显,其中以MEC-1细胞增加最为显著;照射后0.5和4 h,γH2AX阳性细胞率达到100%,照射后24 h逐渐下降,其中Hela细胞下降最为明显。结果提示,克隆形成实验、中性彗星电泳和γH2AX焦点检测法的联合使用能有效预测肿瘤细胞辐射敏感性。     

富勒烯赖氨酸衍生物对AHH-1细胞防护效应研究

本文研究了富勒烯赖氨酸衍生物C60-Lys对AHH-1细胞的辐射防护作用,并对其防护机理进行了初步研究。发现800mg/LC60-lys能提高辐照后AHH-1细胞存活率,在8Gy照射剂量时,给药组与对照组AHH-1细胞存活率分别为64.6%和41.3%。荧光凋亡实验发现,当C60-lys浓度为1200mg/L时,凋亡率为16.3%,这明显低于单纯辐照组的39.2%。在800mg/LC60-lys和4Gy辐照剂量时,给药时间对细胞存活率有显著影响,辐照前给药,AHH-1细胞平均存活率是85.6%,而辐照后给药则是64.1%。C60-lys降低4Gy辐射引起的AHH-1细胞的G2期阻滞及辐射对AHH-1细胞DNA损伤,尤其是减少8-羟基-2'脱氧鸟嘌呤核苷(8-OHdG)含量。     

AS1411辐射增敏机理的研究

为研究AS1411对宫颈癌HeLa细胞的辐射增敏机理,采用γ-H2AX免疫荧光法观察HeLa细胞DNA损伤情况;流式细胞术检测AS1411对HeLa细胞周期及凋亡的影响。结果显示:经AS1411预处理的HeLa细胞核内DNA断裂点数目明显增多;AS1411预处理不影响由辐射引起的细胞周期阻滞,但能够促进辐射诱导的HeLa细胞凋亡率的增长。AS1411通过阻止由辐射引起的DNA损伤的修复及诱发细胞凋亡增加HeLa细胞的辐射敏感性,但此作用机理与细胞周期无关。     

三种肿瘤细胞对γ射线辐射敏感性的比较

选取对数期生长细胞接受0～6Gy^60Coγ射线照射。用克隆形成法检测细胞的存活率，并比较三种细胞的D50（细胞存活分数为50％时的剂量），以衡量细胞的辐射敏感性。同时，以α/β值作为标准衡量了三种细胞的修复能力并与各自的辐射敏感性进行了对比。结果显示，在0～6Gy剂量范围内，三种细胞的辐射敏感性呈现一定差异，在相同的剂量照射下，SMMC-7721细胞的存活分数最高，而A375细胞的存活分数最低。从剂量-存活曲线可以计算出SMMC-7721、HeLa和A375三种细胞的D50分别为2．3、1．9和1．2Gy；其α/β分别为0．36、2．35和5．6。表明三种细胞的辐射敏感性由高到低依次为A375、HeLa、SMMC-7721，而其修复能力由高到低依次为SMMC-7721、HeLa、A375。     

60Co γ射线照射对K562细胞凋亡的影响及其作用机制的研究

采用不同剂量的^60CoY射线照射人红细胞系白血病细胞（K562细胞），于照射后不同时间用流式细胞仪检测细胞凋亡率、蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bel-2和Bax、流式细胞仪检测细胞周期的变化，以探讨^60CoY射线照射对K562细胞凋亡的影响及其作用机制。结果表明，与正常对照组相比，3和7Gy剂量组在照后48和72h，10、15和20Gy剂量组在照后72h细胞凋亡率显著升高。2Cy照射后24h，照射组的Q／M期阻滞明显（P〈0．05），S期细胞比例明显减少（P〈0．05），照射组Bel-2／Bax比例明显比正常对照组降低。以上结果说明，随着照射剂量的增加和时间的延长，细胞凋亡率有随之上升的趋势；y射线对细胞周期的影响主要是显著的G2／M期阻滞和S期细胞减少；y射线可能是通过线粒体途径诱导K562细胞凋亡。     

钙结合蛋白S100A8在γ射线损伤小鼠巨噬细胞RAW264.7中的作用

为探索钙结合蛋白S100A8在γ射线对造血免疫系统损伤中的作用,构建S100A8真核表达载体,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,研究S100A8在γ射线诱导RAW264.7细胞周期紊乱和胞内活性氧改变中的作用。运用RT-PCR和细胞荧光免疫方法鉴定增强表达S100A8的RAW264.7稳定细胞克隆。流式技术检测10Gyγ射线照射6h后细胞周期及H2O2刺激后胞内活性氧的变化。结果显示,与转染空质粒的对照细胞相比,增强表达S100A8细胞克隆G0/G1期细胞比例增高,S期细胞减少,不发生G2/M阻滞;并且H2O2作用后细胞中活性氧水平低于转染空白质粒的细胞。因此,增强表达S100A8的RAW264.7细胞与转染空白质粒细胞相比对辐射更具抗性,其可能原因是与增强表达的S100A8分子具有抗氧化功能有关。     

钴-60伽玛射线诱导淋巴细胞γH2AX表达的研究

采用流式细胞术检测60Coγ-射线照射后γH2AX表达的量效和时程关系,同时探讨紫外线联合60Coγ-射线照射后γH2AX的表达情况。结果表明,不同剂量60Coγ-射线照射后γH2AX表达量与照射剂量之间呈现明显的剂量效应关系。4 Gy 60Coγ-射线照射后,γH2AX的表达在1 h达到峰值,随后逐渐减少。与假照组相比,单纯紫外线照射组γH2AX表达增加,一直稳定维持约6 h左右,随后开始减少。紫外线联合60Coγ-射线照射组与单纯60Coγ-射线照射比较,γH2AX的表达无显著性差异。结果提示采用流式细胞术检测γH2AX的表达估算受照剂量具有可行性,该法有望成为估算辐射剂量的新方法。     

WORT增强γ射线对SHG44细胞周期及凋亡的影响

研究渥曼青霉素（Wortmannin,WORT）对人脑胶质瘤细胞辐射增敏作用及诱导细胞凋亡。用克隆法、流式细胞术和激光共聚焦显微镜扫描技术检测细胞克隆形成、细胞周期和凋亡以及凋亡的形态学特征。结果表明：WORT能抑制细胞克隆形成,和^60Coγ射线联用抑制作用增强,表现出协同作用。WORT和^60Coγ射线联用能引起SHG-44细胞G1期阻滞,WORT能增强^60Coγ射线诱导的细胞凋亡,凋亡细胞核固缩和核碎裂,可见凋亡小体。以上结果表明,WORT可能通过诱导细胞G1期阻滞和凋亡途径来增加细胞的辐射敏感性。     

辐射诱导p53腺病毒重组体转染对结直肠癌细胞周期的影响

以复制缺陷型重组腺病毒载体（AdCMV-GFP）为对照,用复制缺陷型p53重组腺病毒载体（AdCMV-p53）转染经0．5、1．0、2．0Gyγ射线照射的HT-29细胞,克隆形成法检测对细胞的抑制作用,流式细胞分析法检测细胞周期和细胞凋亡,探讨辐射诱导对AdCMV-p53转染p53突变型结直肠癌细胞（HT-29细胞系）细胞周期的影响。结果显示,0．5—1．0Gy辐射诱导明显增强40MOIAdCMV-p53转染对HT-29细胞的抑制。与AdCMV-p53转染对照相比,1d后,辐射诱导转染组G0／G1期细胞减少5％-15％,s期细胞增加2％-19％,2．0Gy辐射诱导80MOI AdCMV-p53转染组G2／M期细胞增加12％;3d后,0．5、1．0Gy辐射诱导40MOI AdCMV-p53转染组G2／M期细胞分别增加10%-13％。辐射诱导AdCMV-p53转染组细胞凋亡与辐射诱导剂量和AdCMV-p53转染剂量相关。以上结果表明,辐射诱导加速AdCMV-p53转染细胞由Go／G1期到S期的进程,促进S期阻滞和G2／M期阻滞发生。     

60Co γ射线照射对k562细胞周期变化的影响

以不同剂量的60Co γ射线照射人红白血病细胞系k562细胞,用流式细胞仪检测照射后24小时及不同时间点的细胞周期变化.照后24小时检测结果表明,随着照射剂量的增加,G2/M期细胞比率增加,剂量达15 Gy时,出现明显的G2/M期阻滞;随着剂量的进一步增加,S期细胞比率逐渐增加,剂量达30 Gy时出现明显的S期阻滞;在此剂量(5～30 Gy)下,细胞凋亡未见明显变化.不同时间点的检测结果表明,随着照射剂量的增加,k562细胞从以G2/M期阻滞为主逐渐转化为以S期阻滞为主,同时细胞凋亡也明显增加.     

电离辐射对HelaS3细胞凋亡与细胞周期的影响

研究了电离辐射对HelaS3细胞凋亡和细胞周期的影响,进一步探讨细胞凋亡与细胞周期的关系,为肿瘤放化疗方案的制定提供基础资料。采用PI、Hoechst33342双梁和PI单梁,用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果表明,给予0.5-4.0Gy X射线照射后8h细胞凋亡开始增加,12h达最大值,12－24h有下降趋势,但24h开始又逐渐增加,到72h时又接近12h水平。S期和G2／M期细胞均明显增加,并呈剂理依赖性,Go/G1期细胞则呈剂量依赖性减少,且这种变化在受照射后24h最明显。说明一定剂量电离辐射可以诱导明显的G2/M阻滞和S期阻滞,并可诱导HelaS3细胞凋亡的产生,两者之间有一定的关系。     

不同剂量X射线照射对小鼠胸腺、脾脏、肝脏细胞凋亡及p53基因表达的影响

采用X射线全身照射小鼠，在普通光镜及流式细胞仪（FCM）下检测细胞凋亡，用免疫组织化学方法检测p53蛋白的表达。结果表明，照射剂量在2-8Gy范围内，脾脏、胸腺细胞凋亡率随照射剂量的增加而升高，细胞周期阻滞于G1期，凋亡率最高在照后8-12小时。肝脏细胞凋亡率最高峰出现在照后24小时，S期和G2／M期细胞阻滞增多。脾脏、胸腺细胞中p53蛋白表达阳性，肝脏细胞中p53蛋白表达阴性。     

γ射线与电磁辐射联合对白血病细胞的作用研究

采用了细胞计数、细胞形态学、流式细胞仪分析方法，用^137Cs照射源，剂量4Gy，磁场强度10MT，频率250Hz照射人早幼粒白血病细胞（HL-60细胞），研究了γ射线与电磁辐射联合对白血病细胞的作用。结果表明，单独γ射线和单独磁场照射均能不同程度地杀伤HL-60细胞，但γ射线与电磁辐射联合作用杀伤HL-60细胞能力更强。电磁场能增加γ射线杀伤HL-60细胞是通过增加γ射线诱导HL-60细胞调亡的发生。     

槲皮素促进电离辐射引起的衰老细胞发生凋亡

研究槲皮素对10 Gy的X射线及碳离子束辐照后衰老的人眼基底脉络膜黑色素瘤细胞系92-1凋亡发生及相关蛋白表达水平的影响。采用流式细胞术及衰老相关半乳糖苷酶检测试剂盒检测92-1细胞经10 Gy的X射线及碳离子束辐照后细胞凋亡及衰老情况。通过Cell counting kit-8(CCK8)法检测槲皮素对92-1细胞增殖活力的影响并结合细胞凋亡检测筛选槲皮素作用浓度。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测不同处理后92-1细胞的凋亡比例。采用蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的表达水平。结果表明,92-1细胞经10 Gy的X射线或碳离子束辐照后3 d,细胞出现明显的衰老表型,凋亡发生率较低。CCK8法结合细胞凋亡筛选出50μmol/L作为后续处理浓度。辐照后立即或3 d后给予槲皮素处理能诱导细胞发生明显的凋亡,且Cleaved caspase-3表达水平显著上调。因此,槲皮素可促使辐照(10 Gy)后衰老的92-1细胞发生凋亡。     

12C6+离子束照射不同肿瘤细胞显示重离子治疗癌症的明显优势

通过观察两种人恶性肿瘤细胞(人肝癌细胞SMMC-7721和人黑色素瘤细胞A375)对高LET12C6 离子和γ射线辐照的敏感性及其差异,考察重离子治疗肿瘤的可行性及优势.以这两种体外培养的来源于人体不同组织的具有高辐射抗性的恶性肿瘤细胞为实验对象,分别进行12C6 和γ射线0-6Gy内不同剂量点的单次和分次照射,采用克隆存活法统计细胞的存活分数.结果显示,无论是单次还是分次照射,12C6 照射后两种细胞的存活分数均明显低于γ射线照射,而且两种细胞的辐射敏感性差异明显降低,同时分次照射细胞的存活分数没有明显提高.结果表明,高LET重离子照射对肿瘤细胞能明显提高杀伤能力,同时降低了不同细胞辐射敏感性的差异且导致细胞低的修复.以上特点与重离子剂量深度分布相结合,使得重离子在治疗肿瘤时具有特殊的优势.     

低剂量辐射诱导胸腺细胞凋亡及细胞周期进程适应性反应的剂量效应

本研究采用X射线全身照射昆明系雄性小鼠模型,通过流式细胞仪观察低剂量辐射诱导胸腺细胞凋亡及细胞周期进程适应性反应的诱导剂量(D1、剂量)及其后攻击剂量(D2剂量)的剂量范围.动物随机分为假照组、D2对照组和D1+D2实验组.结果表明,D1+D2组胸腺细胞凋亡小体百分数不同程度地低于D2组,并且减轻G1和G2+M期阻滞,导致S期DNA合成的细胞增加;当D1达200 mGy时,不再诱导胸腺细胞凋亡及细胞周期进程的适应性反应.本实验结果说明,D1在25～100 mGy(剂量率为12.5mGy/mim),D2在1.0～2.0 Gy(剂量率为0.287 Gy/min),接受D1和D2照射的时间间隔为6h,可在全身照射条件下诱导小鼠胸腺细胞凋亡和细胞周期进程的适应性反应.