FQ-PCR联合Sanger测序法检测结直肠癌患者表皮生长因子受体、KRAS及BRAF基因突变

目的建立实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)联合Sanger测序法快速检测结直肠癌患者表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、KRAS和BRAF基因突变的方法。方法根据结直肠癌中EGFR、KRAS和BRAF基因常见突变类型设计引物及其TaqMan探针序列,以提取的86份结直肠癌患者肿瘤组织DNA为模板,进行FQ-PCR扩增,PCR产物经SAP酶和EXOⅠ酶作用后,收集酶切产物,进行测序PCR扩增,扩增产物经乙醇/醋酸钠法纯化后进行测序,测序结果采用Bioedit软件进行分析;检测EGFR、KRAS及BRAF基因突变,并与FQ-PCR法检测KRAS12/13密码子突变进行比较。结果成功建立了FQ-PCR联合Sanger测序法检测结直肠癌患者样本中EGFR、KRAS和BRAF基因突变的方法,各基因PCR扩增曲线均为标准的"S"型荧光扩增曲线,测序峰图清晰、稳定。86份结直肠癌样本中,EGFR基因突变概率2.3%(2/86),均为第21号外显子点突变,突变类型为L858R和L861Q;KRAS基因突变概率33.7%(29/86),其中第12位密码子突变占79.3%(23/29),突变类型为G12D和G12V,第13位密码子突变占10.3%(3/29),突变类型为G13D,第12和13位密码子同时突变1例(3.4%),第61位密码子未检测到突变,第146位密码子仅检测到2例突变,占6.9%(2/29),突变类型均为A146V;BRAF基因未检测到突变。FQ-PCR法检测KRAS12/13密码子突变概率高于FQ-PCR联合Sanger测序法,但差异无统计学意义(P0.05),两种检测方法的总体符合率为97.7%(84/86)。结论实时FQ-PCR联合Sanger测序法可快速检测结直肠癌患者中EGFR、KRAS和BRAF基因突变,检测方法稳定、可靠。     

苯丙氨酸羟化酶基因突变家系PCR-SSCP分析

目的探讨聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测方法对确定苯丙酮尿症(PKU)患者基因突变来源的应用价值,以便更好地应用于PKU基因诊断和产前诊断。方法对15例确诊的经典型PKU患者及其双亲的PAH基因的第3、5、6、7和11外显子及部分内含子行PCR扩增和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析;无PKU家族史的正常人作为正常对照。PCR-SSCP检测出异常外显子行PCR正、反向测序确定突变类型并分析患者的基因突变来源。结果5例患者的30个等位基因共检出16个突变,共14个突变等位基因来源均得到确定,1例患者(基因型为G247V/R243X)的突变来源未能确定。结论(1)PCR-SSCP检测方法可以确定PKU患者的基因突变来源(包括纯合突变和杂合突变),但对于2个基因突变位于同一外显子的杂合子患者,该方法不能很好地确定基因突变来源。(2)PCR-SSCP方法能够区分基因突变纯合子与基因突变杂合子。     

巢式PCR-RFLP检测大便K-ras基因第12位密码子点突变

用巢式PCR－RFLP分析技术,扩增大便中K－ras基因第12位密码子所处的一段外显子,根据BstNI内切酶的多态性,分析K－ras基因第12位密码子是否突变。结果在22例结肠直肠癌患者的术后石蜡包埋组织中,检出10例（45.5％）K－ras突变,该10例患者中,有8例（36．4％）患者的术前大便中检出K－ras基因突变。这种方法快速、简便、特异、敏感,且可避免大便中多种物质对PCR的干扰。对可疑人群具有实际应用价值。     

成骨不全症患者LEPRE1基因突变位点的筛查

目的对COL1A1和COL1A2基因突变检测为阴性的成骨不全症患者进行隐性致病基因LEPRE1的筛查。方法采集成骨不全患者外周血样,提取基因组DNA,PCR扩增LEPRE1基因,直接测序法进行突变检测;采用PolyPhen、Align GVGD和SIFT突变功能预测软件分析突变对蛋白功能的影响。结果检测到1例成骨不全症患者在LEPRE1基因第5号外显子发生碱基GGA>AGA,发现甘氨酸被精氨酸替换的1个杂合突变位点(c.1045G>A,p.Gly349Arg);其母亲和外祖父有相同杂合突变,家庭其他成员和200份健康对照样本未检测到该突变;PolyPhen、Align GVGD和SIFT软件预测结果表明,p.Gly349Arg突变很可能影响蛋白的正常功能。结论 LEPRE1基因c.1045G>A突变很可能是成骨不全症潜在的致病突变位点。     

新疆多民族地区三阴性乳腺癌BRCA1基因突变分析

目的研究新疆多民族地区三阴性乳腺癌(TNBC)BRCA1基因的突变情况及突变者与未突变者临床、病理组织特征的差异。方法以新疆多民族地区130例TNBC患者为研究对象,从静脉血提取基因组DNA,采用PCR联合直接测序法检测BRCA1基因突变情况。结果 130例TNBC患者BRCA1突变率为17.7%(23/130),其中汉族与少数民族TNBC患者BRCA1突变率分别为20.5%(17/83)、12.8%(6/47),差异无统计学意义(χ2=1.856,P=0.869)。130例TNBC患者中发现23例BRCA1突变的19个位点,其中8个为新发现的位点;4个BRCA1基因突变"热点";此外还发现了9例(6.9%,9/130)致病性突变,5例无义突变,4例移码突变。早发性TNBC组BRCA1突变率28.3%(13/46)高于晚发性TNBC组11.9%(10/84),差异有统计学意义(χ2=5.460,P<0.05)。BRCA1基因突变组与BRCA1基因未突变组相比,发病年龄早,腋窝淋巴结转移率高,TNM分期晚,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论新疆多民族地区TNBC患者BRCA1基因突变率高;突变者与未突变者相比,存在临床病理组织差异。     

MBL EXONⅠ54位基因突变检测方法的建立及初步应用

目的建立MBL基因点突变的检测方法,探讨健康汉族人MBL 54位密码子基因突变的情况.方法根据MBL基因序列设计引物,建立MBL的PCR-RFLP测定点突变的方法.结果扩增产物测序结果与预期扩增的目的基因序列一致,检测灵敏度为80ng/ml,用其检测58例健康献血员54位密码子的点突变情况,野生型为29例,占50%;突变杂合型为27,占46.55%;突变纯合子型为2例,占3.45%.基因频率A为0.732 8;B为0.267 2.结论该方法是特异、灵敏的检测方法.     

多发性骨髓瘤p16基因甲基化与其预后的相关性

目的探讨多发性骨髓瘤p16基因甲基化与其预后之间的相关性。方法采用甲基化敏感的限制性内切酶联合聚合酶链反应方法(REP法),检测52名多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓细胞p16基因第1外显子的甲基化状态,并检测存在p16基因第1外显子甲基化的MM患者p16基因的mRNA转录水平。对这52名患者的临床资料及预后因素进行分析。结果52名MM患者中,p16基因启动子区第1外显子甲基化率为53.84%(28/52)。存在p16基因第1外显子甲基化的MM患者中,p16基因mRNA阴性率为75%。p16基因甲基化患者的预后不良因素明显高于非甲基化患者。结论多发性骨髓瘤p16基因甲基化与其预后有关。     

采用巢式PCR-RFLP检测胰液中突变的Kras基因

采用多聚酶链 限制性片段长度多态性检测技术 ,对临床上可疑的胰腺炎和胰腺癌患者 ,经收集胰液进行K ras基因第 12位密码子突变检测 ,以诊断或鉴别诊断胰腺癌。结果在 2 2份胰液标本中 ,11例胰腺炎均无K ras基因突变 ;在 11例胰腺癌病例中有 9例 (81 2 % )含K ras基因突变     

乙型肝炎病毒基因组C区启动子突变位点新型检测方法的建立、验证及初步应用

目的利用错配扩增和荧光PCR技术,建立一种针对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因组C区启动子(basal core promoter,BCP)1762/1764突变位点的新型检测方法,并对该方法进行验证及临床评价。方法根据NCBI登录的HBV A-H型基因序列(以GenBank号为AB033556.1的C基因型作为标准参考序列)合成野生型和突变型标准品序列,测序后连接至pMD-18T载体上,构建质粒标准品,设计引物、探针及合适的突变检测体系,确定检测的线性范围;对建立的方法进行灵敏度、重复性、特异性、稳定性验证;分别用本实验建立的ARMS-PCR法和基因Sanger测序法(金标准)检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本的基因位点是否发生突变,并分析ARMS-PCR法的灵敏度和特异度。结果 ARMS-PCR法能检测1×102~1×109 copies/ml的野生型和突变型质粒;野生型和突变型样本检测的Ct差值(ΔCt)在7以上,且能检出最低达1%突变含量的混合质粒和样本;该方法灵敏度较高,重复性、特异性、稳定性良好;其检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本1762/1764位点突变阳性率为41.7%,明显高于Sanger测序法检测结果(P0.05)。结论建立的ARMS-PCR法能很好地用于评估乙肝患者患肝癌的风险,且较Sanger测序法检测精度更高,更适合于临床推广。     

结核病药效评价用结核分枝杆菌参考菌株的筛选

目的筛选结核病(tuberculosis,TB)药效评价用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)国家参考菌株。方法取169株MTB临床分离株,采用结核杆菌生长指示管(mycobacterial growth indicator tube,MGIT)960液体培养基,对4种一线抗TB药物[链霉素(streptomycin,STR)、异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampin,RFP)和乙胺丁醇(ethambutol,EMB)]进行药敏试验,并对耐INH和/或耐RFP的菌株的相关耐药基因位点进行测序,确认突变位点;用间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)对所有菌株进行基因分型,多位点可变数量串联重复序列分型方法(mutiple loci VNTR analysis,MLVA)对北京家族MTB临床分离株进行基因分型。结果 169株MTB临床分离株中耐STR 118株,INH 143株,RFP 129株,EMB 95株,耐多药(至少对NIH和RFP耐药)120株,单耐INH 5株,单耐RFP7株,四种抗TB药均敏感共11株。143株INH耐药菌株中,kat G基因突变菌株占76.9%,inh A基因突变菌株占27.3%,aph C基因突变菌株占25.2%,至少2个基因发生突变的菌株有31株;129株RFP耐药菌株中,rpo B基因531位点发生突变,占67.4%,526位发生突变,占17.8%,516位点发生突变,占16.3%,至少2个位点发生突变的菌株有10株。169株MTB临床分离株分为北京家族和非北京家族,北京家族111株;非北京家族58株,主要有CAS家族2株,EAI家族7株,H家族11株,LAM家族6株,MANU家族6株,T家族7株,U家族1株,X3家族3株,还有15株在数据库中未表现的新基因型。111株北京家族MTB临床分离株分为4大群,其中Ⅱ群分布最广,占68.5%,代表性最好。筛选出耐多药菌株27株,敏感菌株5株,单耐异烟肼2株,单耐利福平3株。结论成功筛选出敏感菌株、单耐药菌株、MDR菌株作为候选菌株。