结核分枝杆菌RD1区重组11 kD蛋白的克隆表达及效力

目的在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD1区11kD蛋白,并检测表达产物的效力。方法构建11kD蛋白编码基因原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)IPTG诱导表达,离子层析柱分离纯化重组蛋白。以结核分枝杆菌致敏豚鼠进行皮肤变态反应(DTH)测定。结果结核分枝杆菌11kD蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,表达蛋白占总菌体蛋白的33%以上,纯化后纯度达95%以上,并可诱导结核分枝杆菌致敏豚鼠产生迟发型超敏反应,5μg/ml11kD蛋白的效力与50IU/ml TB-PPD相当。结论重组11kD蛋白已在大肠杆菌中成功表达,并有望成为结核病皮试鉴别诊断用新试剂。     

斑马鱼模型评价BCG-CpG-DNA的安全性

目的用斑马鱼模型对BCG-CpG-DNA进行安全性评价。方法以斑马鱼胚胎为实验材料,将BCG-CpG-DNA设置4个浓度组(0.15、1.5、15、75 mg/L),暴露斑马鱼,以胚胎培养液暴露为空白对照组,以三甲基氯化锡(TMT)和全氟辛烷磺酸盐(PFOS)暴露为阳性对照组,胚胎期6 hp(f受精后6 h)脱膜,8 hpf进行暴露毒性实验,研究其对斑马鱼发育、遗传、免疫以及行为的毒性影响。每组做3个重复,试验重复3次。结果未观察到BCG-CpG-DNA各浓度组的斑马鱼胚胎明显的畸形和孵化死亡情况,其自主运动、触摸运动、行为检测、免疫强度检测与空白对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。TMT对照组暴露对斑马鱼生长、发育、免疫及其神经等均有不同程度的影响,导致心胞肿大,对光暗刺激反应敏感,相对荧光强度明显增强,嗜中性粒细胞数量增多,对炎症的敏感性增强,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BCG-CpG-DNA暴露对斑马鱼生长、发育、免疫及其神经均无明显的急性毒性作用,在斑马鱼的胚胎暴露中具有较好的安全性。     

压缩机焊接后的氧化皮的消除

解决空调压缩机焊接后的氧化皮的消除的试验过程和方法。     

结核病高危人群预防用无细胞耻垢分枝杆菌疫苗的研制

目的研制结核病高危人群预防用无细胞耻垢分枝杆菌疫苗(MS疫苗)。方法耻垢分枝杆菌培养物经多次洗涤后,制备所需浓度的菌悬液,高压匀浆后,经高压灭菌、稀释、分装、冻干,制成MS疫苗。将结核杆菌感染的豚鼠随机分为A组(接种疫苗8.7μg/次)、B组(接种疫苗17.5μg/次)和C组(接种生理盐水),观察疫苗对结核杆菌感染豚鼠的保护作用。结果MS疫苗浓度确定为每支蛋白含量为17.5μg(0.25mg湿菌)。疫苗具有良好的安全性,且可有效抑制或杀死豚鼠体内的结核杆菌,减轻豚鼠各脏器的病变程度。结论已成功制备MS疫苗,其对结核杆菌感染动物有较好的预防效果,有望成为结核病高危人群预防用疫苗。     

结核杆菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测用参考品的制备

目的建立结核杆菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测用国家参考品。方法收集分枝杆菌菌株,用经典的药敏试验及培养基鉴别试验进行鉴定;用分子生物学技术对耐药菌株的耐药基因进行核苷酸序列分析,并进行突变位点的筛选;选取完全耐药菌株,用膜过滤法制备单细胞菌液,进行显微计数。结果选出阳性参考品符合率检测用、含不同突变位点的结核分枝杆菌耐药菌株20株;阴性参考品符合率检测用菌株10株,其中敏感菌株5株,致病性非结核分枝杆菌菌株5株;最低检出量检测用结核分枝杆菌耐药菌株5株,制备浓度为1×106个/ml的单细胞菌液。结论该参考品可以用作结核菌利福平与异烟肼耐药基因快速检测试剂质量的标准。     

P-HTPM对荚膜组织胞浆菌和不同分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤试验

目的通过荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物(P-HTPM)对荚膜组织胞浆菌(HC)和不同分枝杆菌致敏豚鼠的皮肤试验,检测P-HTPM用于组织胞浆菌病(HP)和结核病鉴别诊断的特异性和敏感性。方法用结核分枝杆菌(MTB)和22种非结核分枝杆菌以及荚膜组织胞浆菌(HC)分别致敏豚鼠,经皮内注射结核杆菌纯蛋白衍生物(TB-PPD)、胞内分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD-B)、P-HTPM或国外同类产品HDS,检测P-HTPM的特异性;将P-HTPM原液分别稀释成1、2、4、8μg/ml,与HDS同时以轮圈法注射于经HC致敏的豚鼠,检测P-HTPM的敏感性;用MTB、MTB+HC和不同浓度的HC分别致敏豚鼠,再分别经皮内注射TB-PPD和P-HTPM,检测交叉反应性。结果P-HTPM与HDS对HC致敏的豚鼠均呈阳性反应,而对结核及其他分枝杆菌致敏的豚鼠均呈阴性反应;不同浓度的P-HTPM均可诱导HC致敏豚鼠的皮肤反应,并随P-HTPM浓度升高,皮肤反应强度略有增强,1μg/ml的P-HTPM即与HDS诱导的皮肤反应等效;TB-PPD及P-HTPM对自身抗原致敏的豚鼠均可诱导较强的皮肤反应,且明显强于MTB+HC混合抗原致敏豚鼠诱导的皮肤反应;TB-PPD对HC致敏的豚鼠个别呈弱阳性,但随HC致敏浓度的升高,其阳性率下降。结论P-HTPM用于HP和结核病的鉴别诊断具有较好的特异性和敏感性。     

结核病药效评价用结核分枝杆菌参考菌株的筛选

目的筛选结核病(tuberculosis,TB)药效评价用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)国家参考菌株。方法取169株MTB临床分离株,采用结核杆菌生长指示管(mycobacterial growth indicator tube,MGIT)960液体培养基,对4种一线抗TB药物[链霉素(streptomycin,STR)、异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampin,RFP)和乙胺丁醇(ethambutol,EMB)]进行药敏试验,并对耐INH和/或耐RFP的菌株的相关耐药基因位点进行测序,确认突变位点;用间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping)对所有菌株进行基因分型,多位点可变数量串联重复序列分型方法(mutiple loci VNTR analysis,MLVA)对北京家族MTB临床分离株进行基因分型。结果 169株MTB临床分离株中耐STR 118株,INH 143株,RFP 129株,EMB 95株,耐多药(至少对NIH和RFP耐药)120株,单耐INH 5株,单耐RFP7株,四种抗TB药均敏感共11株。143株INH耐药菌株中,kat G基因突变菌株占76.9%,inh A基因突变菌株占27.3%,aph C基因突变菌株占25.2%,至少2个基因发生突变的菌株有31株;129株RFP耐药菌株中,rpo B基因531位点发生突变,占67.4%,526位发生突变,占17.8%,516位点发生突变,占16.3%,至少2个位点发生突变的菌株有10株。169株MTB临床分离株分为北京家族和非北京家族,北京家族111株;非北京家族58株,主要有CAS家族2株,EAI家族7株,H家族11株,LAM家族6株,MANU家族6株,T家族7株,U家族1株,X3家族3株,还有15株在数据库中未表现的新基因型。111株北京家族MTB临床分离株分为4大群,其中Ⅱ群分布最广,占68.5%,代表性最好。筛选出耐多药菌株27株,敏感菌株5株,单耐异烟肼2株,单耐利福平3株。结论成功筛选出敏感菌株、单耐药菌株、MDR菌株作为候选菌株。     

低剂量氚β射线和~(60)Coγ射线诱发人淋巴细胞染色体畸变及相对生物效应的研究

介绍了用氚β射线和~(60)COγ射线离体照射G_0期人淋巴细胞诱发染色体畸变的剂量效应关系(剂量范围为0-0.5Gy)。实验表明:无论是氚β射线还是~(60)Coγ射线所诱发的淋巴细胞染色体畸变均以染色体型畸变为主,诱发的双着丝粒体与剂量的关系均适合以Y=a+bD模式来表示。以~(60)Coγ射线为参考辐射,以淋巴细胞染色体畸变为生物终点,测得氚的RBE值为2。