肉毒毒素生物学活性及肉毒中毒病原检测方法的研究进展

肉毒毒素生物学活性的检测和肉毒中毒诊断方法的研究进展迅速,对食品检验、肉毒中毒实验室诊断、生物反恐和肉毒毒素制品的开发及应用具有十分重要的意义。本文就肉毒毒素生物学活性及肉毒中毒病原检测方法的研究进展作一综述。     

D型肉毒毒素蛋白仿生矿化颗粒灭鼠剂的研制及特性分析

[目的]探索提高D型肉毒毒素蛋白对环境温度的耐受性,降低害鼠胃肠内容物对毒素蛋白的破坏强度的仿生矿化工艺,为扩大D型肉毒毒素灭鼠剂适用鼠种及使用范围提供技术依据。[方法]采用先进的仿生矿化技术对D型肉毒毒素进行矿化保护,筛选出D型肉毒毒素仿生矿化颗粒加工工艺流程。利用生物法测定了不同温度下矿化毒素颗粒的热稳定性及口服致死性(LD_(50))。[结果]D型肉毒毒素矿化样品的保存期比对照组明显延长,毒力损失显著降低;矿化毒素对害鼠肠内容物破坏的抵抗力明显降低。矿化毒素颗粒对高原鼢鼠、高原鼠兔、小白鼠的口服毒性最小致死量分别为5200、8600、25 000 MLD/kg;矿化毒素颗粒对2种害鼠的致死性及适口性良好。[结论]采用仿生矿化技术可极大地提高D型肉毒毒素的热稳定性,降低靶动物胃肠内容物对D型肉毒毒素的破坏作用,经矿化处理后的毒素不仅可用于草原害鼠种群密度的控制制剂,而且可拓展至城市鼠害的防治应用,同时该研究对于毒素蛋白物质的保护方法提供了新的思路。     

肉毒毒素的应用现状

肉毒毒素是肉毒杆菌在生长繁殖中产生的一种神经毒素。注入肌肉后，能迅速与突触前胆碱能神经终板结合，减少周围运动神经末梢和神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放，抑制细胞外乙酰胆碱，造成肌肉松弛和麻痹。20世纪70年代末肉毒毒素被开发并逐步应用于临床，以治疗某些神经肌肉疾思。目前，肉毒毒素已经用于眼科、神经科、康复科、消化科及皮肤科(多汗症、美容)等领域50余种病症的治疗，取得了诸多成果。本文就肉毒毒素在临床医疗、医学美容、生物农药等方面的应用情况进行了概述。     

生物毒素成为新药来源

包括蛇毒、蓖麻毒素、河豚毒素和肉毒杆菌毒素在内的生物毒素均为剧毒物质。如1g 肉毒毒素可以毒杀1百万只小白鼠。但世间任何事物均有两重性,生物毒素只要使用得当可以成为一种有效药物。     

注射用A型肉毒毒素的生物学特性及质量分析

目的对注射用A型肉毒毒素(Botulinum toxin type A for injection,商品名衡力,出口商品名BTXA)制品中的活性药用成分(Active pharmaceutical ingredient,API)的性质及2009～2011年生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性进行分析。方法对BTXA收获物样品进行阴离子交换层析,分离毒素复合体各组分;采用血凝试验、HPLC法、SDS-PAGE、等点聚焦电泳及N-末端氨基酸测序等方法分析A型肉毒毒素复合体及其各组分的性质;统计2009～2011年连续生产的注射用A型肉毒毒素原液的比活性数据,分析连续生产的工艺稳定性和质量重现性。结果 BTXA收获物样品在碱性条件下可被解离,解离出的A型肉毒神经毒素相对分子质量约为150 000,无血凝效价;BTXA的API为完整的单体,纯度均在99.5%以上;复合物和神经毒素的等电点分别为4.97、4.91,N-末端氨基酸测序结果与GenBank基本一致;在连续3年的生产过程中,原液比活性平均为3.0×107LD50/mg蛋白,BTXA成品中API载量约为5 ng/瓶。结论注射用A型肉毒毒素的活性成分是特异的复合体结构,可在碱性条件下解离出A型肉毒神经毒素;BTXA原液的比活性在连续3年的生产中持续稳定,具备很好的连续性,为临床使用的安全性提供依据。     

B型肉毒神经毒素的纯化及胰蛋白酶对其作用分析

目的纯化B型肉毒神经毒素,并比较未激活和用胰蛋白酶激活的B型肉毒神经毒素的分子特性,分析在酸性和碱性条件下B型肉毒毒素复合物的完整性。方法取未激活、胰蛋白酶激活和热处理激活的B型肉毒毒素复合物,采用阴离子交换柱层析纯化神经毒素(分别为A、B和C组)。在酸性条件下溶解激活的B型肉毒毒素复合物(D组)。对各组进行纯度(特异毒性)测定和SDS-PAGE分析。结果柱层析后,神经毒素纯度均比复合物的纯度高,激活的神经毒素比未激活的高2～3倍;在非还原和还原条件下,A组的SDS-PAGE显示神经毒素、重链和轻链3条带;B组显示重链和轻链2条带;C组在非还原条件下显示重链和轻链2条带,在还原条件下只显示轻链1条带。在酸性条件下,B型肉毒毒素复合物由神经毒素与非毒性成分构成,在碱性条件下,神经毒素与非毒性成分分离。结论已成功纯化了B型肉毒神经毒素,经胰蛋白酶处理后,单链裂解为双链,比活性提高。     

离子色谱法测定A型肉毒毒素及其胶塞中的氟

建立了离子色谱法测定注射用A型肉毒毒素与其覆聚乙烯-四氟乙烯膜氯化丁基橡胶塞中的氟离子。此方法线性范围为25～400 ng·mL^-1,r为0.9994,检测限为0.1 ng·mL^-1,定量限>0.3 ng·mL^-1,胶塞浸提液中氟离子回收率为83%～88%,RSD为2.4%,注射用A型肉毒毒素中氟离子回收率为88%～104%,RSD为5.9%。本文所建方法简单可行，且胶塞中迁移出的氟离子远小于注射用A型肉毒毒素中含有的氟离子，表明此胶塞有望作为注射用A型肉毒毒素的内包材。     

2002年美国化妆品领域中的肉毒杆菌毒素产品的营业收入达1.26亿美元

20 0 2年美国的肉毒杆菌毒素产品的营业收入为 3 35亿美元 ,其中应用在化妆品领域的占 38% ,达 1 2 6亿美元 ,预期复合增长率为 2 8 4 % ,2 0 0 9年将达到 7 2 9亿美元。预期在治疗领域的复合增长率为 18 9% ,将由 2 0 0 2年的 2 0 9亿美元增长到2 0 0 9年的 7 0 1亿美元。整体肉毒杆菌毒素的营业收入率预期将会以2 3 0 1%的速率增长 ,而化妆品市场占整体肉毒杆菌毒素产品市场比率也将自 2 0 0 2年的 38%逐年提升 ,2 0 0 9年将达 5 1%。美国FDA是在 2 0 0 2年才许可肉毒杆菌毒素产品Botox用于化妆品除皱用途的 ,但温哥华皮肤科的医生早在…     

针刺结合A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛疗效观察

目的探讨针刺结合A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛的疗效。方法对我院80例面肌痉挛患者采用针刺结合A型肉毒杆菌毒素进行治疗。结果本组完全缓解71例(88.75%),明显缓解7例(8.75%),部分缓解2例(2.5%)。发生面肌无力感8例,轻微上睑下垂5例,均于1个月内自然恢复,均无全身反应,肝功能及尿常规均未见异常。结论采用针刺结合A型肉毒杆菌毒素治疗面肌痉挛,简便易行,无全身反应,疗效维持时间长,费用低廉,患者易接受,值得临床推广。     

小鼠E型肉毒毒素中毒血清蛋白差异分析

目的以小鼠为动物模型研究E型肉毒毒素中毒血清蛋白变化,寻找中毒相关蛋白,为肉毒中毒早期诊断及预后寻找新的生物标记分子。方法经腹腔注射昆明系近交小鼠E型肉毒毒素0.75 LD_(50),分别于24、48、72 h后眼眶采血,分离血清,SDS-PAGE结合2-DE-SDS-PAGE分离血清蛋白,PDQUest 8.0软件对凝胶进行背景消除和点的匹配,离子阱质谱检测差异蛋白点。结果 SDS-PAGE条带显示,中毒24 h血清蛋白变化最明显,正常血清和中毒24 h血清2-DE图谱找到20个差异蛋白点,其中14个只存在小鼠正常血清中,3个只存在肉毒中毒血清中,3个在肉毒中毒呈现低量表达。质谱检测出晶体蛋白家族,只在正常小鼠血液中表达;急性期蛋白在E型肉毒毒素中毒24 h出现明显变化,其中结合珠蛋白在中毒血清中低表达,而血清淀粉样蛋白A高表达。结论这些鉴定出的蛋白涉及机体能量代谢、肌肉收缩功能、细胞应激反应、转录、翻译以及细胞增殖的改变,尤其是结合珠蛋白和血浆淀粉样蛋白可初步作为潜在的诊断标记分子。     

用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备

目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在E.coli中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。     

A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的非临床安全性评价

目的分析注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素活性药用成分(active pharmaceutical ingredient,API)的纯度、N-末端氨基酸序列和相对分子质量,并通过多个非临床研究试验,评价两种制品在药理、毒理特性等方面的一致性。方法采用SDS-PAGE法检测注射用A型肉毒毒素(衡力~,Lantox~,以下简称复合物)和注射用A型肉毒神经毒素(Chintox~,以下简称神经毒素)的纯度;对其N-末端氨基酸序列进行测序,并将测序结果与NCBI blast数据库中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列比对,确证其各组分的成分;毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)检测其在非还原及还原条件下各组分的相对分子质量;单次肌肉注射、静脉注射、灌胃给予大鼠及单次肌肉注射给予食蟹猴的试验评价复合物和神经毒素的急性毒性;重复肌肉注射给予食蟹猴39周和恢复期12周的药理毒理试验评价复合物和神经毒素的长期毒性;家兔红细胞的体外溶血试验评价两者的溶血性;肌肉注射给予大鼠Ⅰ、Ⅱ段生殖毒性试验评价肉毒毒素的生殖毒性。结果神经毒素组:非还原条件下,神经毒素相对分子质量约152 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,为完整的A型肉毒神经毒素;还原条件下,由相对分子质量约101 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN的重链和相对分子质量约51 000、N-末端氨基酸序列PFVNKQFNYK的轻链组成;复合物组:非还原条件下,含A型肉毒神经毒素(Mr 152 000)、非毒素非血凝素蛋白(non-toxic non-HA,NTNH)(Mr 136 000)、HA70组分(Mr 57 000、17 000)、HA33组分(Mr 30 000、28 000)和HA17组分(Mr 15 000),还原条件下,则含有重链、轻链、NTNH、HA70、HA33和HA17组分。注射用A型肉毒毒素、注射用A型肉毒神经毒素单次肌肉注射和静脉注射给予大鼠,肌肉注射的最大耐受剂量≥100 U/kg,静脉注射的最大耐受剂量≥30 U/kg;单次肌肉注射给予食蟹猴所产生的急性中毒反应与死亡情况一致,最大耐受剂量均为20 U/kg,近似致死剂量为40 U/kg;反复肌肉注射给予食蟹猴的试验中,未见明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)均为16 U/kg;在体外对家兔红细胞无溶血作用,不引起红细胞凝聚;Ⅰ段生殖毒性试验对雄鼠生育力的NOAEL为4U/kg,对雌鼠生育力的NOAEL为8 U/kg,对孕鼠早期胚胎发育的NOAEL为16 U/kg;Ⅱ段生殖毒性试验对孕鼠的NOAEL为1 U/kg,对胚胎-胎仔毒性和致畸性的NOAEL为16 U/kg。结论注射用A型肉毒毒素和注射用A型肉毒神经毒素在食蟹猴和大鼠的急性毒性、长期毒性等试验中,剂量、动物病理解剖结果一致,进一步说明A型肉毒毒素和A型肉毒神经毒素的药理毒理特性是相同的,且在反复肌肉注射给予食蟹猴的长期毒性试验中发现,A型肉毒神经毒素更不易产生抗体。在神经毒素灌胃试验中半数致死剂量高于复合物,表明其安全性更好。     

不同工艺制备的E型肉毒毒素及其类毒素的免疫原性分析

目的用不同工艺制备E型肉毒毒素,脱毒制备类毒素,并分析其免疫原性。方法分别用菌体内提取法和酸沉淀法制备E型肉毒毒素,进行毒素型特异性检定及毒力测定后,脱毒制备类毒素,参考《中国药典》三部(2010版)进行结合价、蛋白氮(PN)含量、总氮(TN)含量、p H测定及脱毒检查和毒性逆转试验。选择结合价较高的2批类毒素配制3组抗原,经家兔皮下进行基础免疫(共2针)和3程超免疫(2针/程),每针间隔14 d,每程免疫间隔30 d,均于第2针免疫后第20天,经耳缘静脉采血,分离血清,参考《中国药典》三部(2010版)附录ⅪH肉毒抗毒素效价检测法,检测抗体效价。结果 55、120 h菌体内提取毒素(201112001和201112003批)及55、120 h酸沉淀提取毒素(201112002和201112004批)均为E型肉毒毒素,毒力分别为6.2×103、5.0×102、4.5×102、6.5×103 LD50/ml;各组类毒素脱毒检查和毒性逆转试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)规定,55 h酸沉淀提取毒素其类毒素TN、PN含量最高,120 h菌体内提取毒素最低。制备的3组抗原(201112001-1、201112004-1及201112004-2批)抗原结合价分别为900、2 100和900 BU/ml;两种方法制备的类毒素按最高结合价配制抗原,免疫后的血清效价差异无统计学意义(P0.05),两种方法制备的类毒素按相同结合价配制抗原及同批类毒素配制的不同结合价抗原,免疫后的血清效价差异均有统计学意义(P0.05)。结论用酸沉淀法从120 h培养液中提取毒素可获得与55 h菌体内提取毒素相同免疫原性的类毒素。酸沉淀法操作简便,更适宜马匹免疫用E型肉毒抗原的规模化生产。     

A、B、E、F型肉毒抗毒素的制备与检定

目的　制备马抗肉毒 (Botulinum)A、B、E、F型抗毒素。方法　菌种经过复苏分离与检定后 ,采用产毒培养、酸沉、盐析及脱毒等步骤 ,制备肉毒A、B、E、F四型类毒素 (Toxoid)和试验毒素 (Testtoxin) ,免疫健康马匹。结果　各型血浆效价均超过 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》中对于抗毒素的要求 ,B型与F型的效价均超过 2倍以上 ,A型与E型也达到较好的应答水平。结论　已成功制备四型肉毒抗毒素。     

破伤风毒素的提纯及形成离子通道的特性

应用硫酸铵分段沉淀和 Ultrogei AcA_(34)凝胶过滤对破伤风毒进行了提纯,并对形成的离子通道在中毒作用中的功能进行了讨论。提纯的毒素与抗粗制毒素血清形成一条沉淀线,于聚丙烯酰胺凝胶电泳中形成单一的蛋白带,分子量为15万,等电点为5.95,毒力为1～3×10~4MLD/μg 蛋白。给小鼠注射低剂量毒素引起迟发性强直性痉挛;注射高剂量毒素引起快速的类肉毒毒素的松弛性麻痹,直至死亡。应用 Patch clamp 技术,破伤风毒素于人工磷脂膜上形成离子通道。只有当膜两侧存有 pH 梯度时毒素才形成离子通道,因此是 pH 依赖的。通道的电导系数为9 PS。     

运用统计学优化A型肉毒毒素的SDS-PAGE染脱色方法

目的运用统计学优化A型肉毒毒素的SDS-PAGE染色和脱色方法,以便生产检定中实现数字化、标准化操作。方法以Photoshop软件对电泳凝胶扫描图采样的背景灰度值、强带灰度值和弱带灰度值作为评价指标,以不同的脱色液为实验因素,按配对设计安排实验,对实验结果进行脱色方法的统计学分析,根据配对设计分析结果,按裂区设计安排第二步实验,对实验结果进行染色和脱色方法的以统计学为主的综合分析评价。结果综合分析显示,电泳凝胶直接由考马斯亮蓝R250-磷酸-乙醇染色液加热至60℃染色2 h,0.5 mol/L KCl结合冰醋酸-甲醇脱色可获得良好效果。结论得到一种具有一定创新性的A型肉毒毒素的SDS-PAGE染脱色方法,该方法具有背景脱色浅淡均匀,条带清晰,染色和脱色液不挥发因而重复性好的优点,能够满足A型肉毒毒素生产检定的需要。     

B型肉毒神经毒素重链C-端片段的修饰及表达

目的修饰、克隆B型肉毒神经毒素重链C-端(BoNT/b HC)片段,并在大肠杆菌中进行表达。方法以B型肉毒梭状杆菌8806株基因组DNA为模板,PCR扩增B型肉毒神经毒素重链的转膜区和结合区,并以高频密码子替换BoNT/bHC基因N-端的5个低频密码子。将目的片段克隆入表达载体pET-42b,转化E.coli BL21(DE3)PlysS,IPTG诱导表达后,进行Western blot鉴定及可溶性分析。结果重组表达质粒经PCR及酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为80000,表达量占菌体总蛋白的32.6%,主要以包涵体形式存在;重组蛋白可被相应的抗BoNT/b全毒素的多克隆抗体所识别。结论已成功修饰并表达了B型肉毒神经毒素重链C-端片段,为进一步研制重组疫苗及高特异性的诊断试剂奠定了基础。     

蓖麻毒蛋白的提取及应用研究

蓖麻毒蛋白是具有强烈细胞毒性的天然毒素之一,其毒性作用在生物农药、医学抗癌、细胞内转运机理研究、生物防恐等方面得到广泛的应用.简述了蓖麻毒蛋白的性质、结构及作用机理,并对蓖麻毒蛋白不同提取方法进行了比较,对其应用研究进行了介绍.     

治疗用A型肉毒结晶毒素的研制及实验动物模型的建立

A型肉毒梭菌结晶毒素是以酸等电点沉淀,磷酸盐提取,核糖核酸酶处理,DEAE-A_(50)离子交换层析,硫酸铵外液透析制备的。毒力强,性能稳定,冻干制品宜于长期保存。经生化学、免疫学试验表明,毒素系神经毒素和血凝素的复合体,纯度高达2.5～2.6×10~7LD_(50)(小白鼠)/mgpr。给实验动物—恒河猴眼外肌注射能致人工斜视再给猴同眼的拮抗肌注射毒素,斜视得以矫正。可望成为一种治疗眼、面等神经、肌肉痉挛性疾病的安全,有效制剂。     

肉毒梭菌培养液澄清过滤工艺的优化

目的优化肉毒梭菌培养液的澄清过滤工艺,并对过滤效果进行验证。方法选择不同型号的过滤器组合对A型肉毒梭菌培养液进行一级、二级澄清过滤,筛选最佳过滤器组合;用最佳过滤器组合对扩大培养批量的A、B、E、F型肉毒梭菌培养液进行澄清过滤。结果 P700K+50P过滤器组合对A型肉毒梭菌培养液进行一级、二级澄清过滤的效果最佳;用该过滤器组合对扩大培养批量的A、B、E、F型肉毒梭菌培养液进行澄清过滤,各型均可达到预期的试验目标。结论筛选出P700K+50P为A、B、E、F型肉毒梭菌培养液澄清过滤的最佳过滤器组合,为肉毒梭菌培养液澄清过滤工艺的进一步优化提供了实验依据。