~(125)Ⅰ标记rLTB-UreB及口服BALB/c小鼠示踪实验研究

目的 观察~(125)Ⅰ标记基因重组融合蛋白LTB-UreB灌喂BALB/c小鼠后的体内分布。方法 采用氯胺T氧化法标记rLTB-UreB,Sephadex-G25凝胶过滤纯化,纸层析鉴定放射化学纯度及比活度。将BALB/c小鼠随机分为PBS口服空白对照组、Na~(125) Ⅰ口服对照组和~(125)Ⅰ-rLTB-UreB实验组,于不同时间采集标本,γ放射计数器检测CPM(每分钟计数值),SPSS分析结果。结果 纯化后的标记蛋白纯度>90％。实验组PP结和肠系膜淋巴结CPM升高,与对照组比较差异有非常显著意义。结论 ~(125)Ⅰ标记融合蛋白口服后可在肠道粘膜下淋巴组织沉积,为融合蛋白作为幽门螺杆菌口服疫苗候选抗原提供重要实验依据。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白功能性片段的原核表达及其免疫保护性

目的表达猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)的功能性片段(tmrp),并检测其对小鼠的免疫保护性。方法将构建的重组克隆载体pMD-tmrp经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将切下的目的基因tmrp亚克隆至原核表达载体pGEX-3X中,转化E.coliBL21(DE3),鉴定正确后,用IPTG诱导,谷胱甘肽亲和层析纯化GST-tmrp,免疫BALB/c小鼠,测定其免疫保护率。结果阳性工程菌经IPTG诱导,表达了可溶性目的蛋白,相对分子质量约为73000。0.8mmol/LIPTG,37℃,pH7.2诱导4h,表达量最高,为25.36%。经亲和层析纯化,融合蛋白纯度达93.7%。免疫BALB/c小鼠后,免疫保护率可达60%。结论已成功获得了具有免疫活性的GST-tmrp。     

重组SARS病毒N蛋白的制备及其初步应用

目的在大肠杆菌中表达重组SARS-CoVN蛋白,并进行纯化,为进一步研制SARS早期诊断试剂奠定基础。方法通过RT-PCR获得SARS-CoVN蛋白基因片段,并克隆至大肠杆菌表达载体pQE30中,构建重组质粒。转化E·coliM15,IPIG诱导表达。经SDS-PAGE和Western blot鉴定,采用Chelating-Sepharose Fast Flow纯化融合蛋白,并免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清抗体水平。结果所构建的重组表达载体pQE30-N经诱导可表达重组SARS病毒N蛋白。该蛋白纯化后,纯度可达90%左右。Western blot检测表明,重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者恢复期血清呈现特异的免疫反应。免疫BALB/c小鼠可获得高效价抗血清。结论重组SARS-CoV N蛋白具有良好的抗原性,可用于SARS-CoV感染的早期诊断。     

产肠毒素大肠杆菌987P菌毛蛋白FasA亚单位的原核表达及其免疫原性

目的表达、纯化产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)987P菌毛蛋白FasA亚单位,并检测其免疫原性。方法将去掉5′端信号肽序列的fasA基因克隆至原核表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-fasA,转化E.coli M15,0.5 mmol/L IPTG诱导表达。表达的融合蛋白6×His-FasA经Ni-Agarose His纯化和复性后,经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,每次100μg,共免疫3次,间隔2周,末次免疫10 d后,摘除小鼠眼球取血,分离血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果重组表达质粒pQE-30-fasA经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的6×His-FasA融合蛋白相对分子质量约为18 500,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%;纯化的蛋白纯度可达95%,浓度为0.6 mg/ml,免疫小鼠所得抗血清效价为1∶125 000。结论已成功在E.coli M15中表达了6×His-FasA融合蛋白,纯化的融合蛋白免疫原性良好,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌多亚单位融合蛋白疫苗的构建及免疫特性

目的构建幽门螺杆菌HspA、HpaA、UreB多亚单位融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性及免疫保护性。方法用PCR从Hp基因组中分别扩增HspA、HpaA、UreB3个基因片段,重叠延伸PCR将其构建成融合基因hhu,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切、测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,AKATA纯化仪纯化。纯化后蛋白口服免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体,末次免疫后进行攻毒试验,检测其免疫保护性。结果酶切及测序证实已成功构建HspA、HpaA、UreB融合基因的表达载体phhu,SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的表达,表达率为26·8%,纯化的融合蛋白纯度大于90%,口服免疫小鼠可产生特异性抗体,保护率达89·6%。结论所获得的融合蛋白保持了亚组分蛋白各自的免疫原性和免疫保护性,为幽门螺杆菌多亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备

目的制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定。方法将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白。表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类。腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价。结果重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95%,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90%,效价达1×106以上。结论成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础。     

大肠杆菌表达CRM_(197)及其在通用流感疫苗中的应用

利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达白喉毒素无毒突变体CRM_(197),经变性条件下亲和纯化后,作为蛋白载体与流感抗原M2e经BMPH偶联,制备CRM_(197)-M2e结合物,用其免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法测定血清中M2e特异性IgG抗体.结果表明,重组CRM_(197)在大肠杆菌中成功表达,优化后蛋白表达量约为250±30 mg/L,纯度达95%以上;所制CRM_(197)-M2e结合物可有效免疫BALB/c小鼠,其刺激产生的M2e特异性IgG抗体滴度分别是健康组、M2e免疫对照组、CRM_(197)免疫对照组及CRM_(197)+M2e混合组的430.5,32,181和215倍.     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白的纯化及免疫学活性

目的纯化人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白,并分析其免疫学活性,为诊断试剂和疫苗的研制奠定基础。方法采用电洗脱的方法纯化目的蛋白,通过免疫双扩散和ELISA法检测其免疫反应性。将该蛋白免疫BALB/c小鼠,分析其免疫原性。结果纯化后的目的蛋白经凝胶灰度扫描显示,其纯度达到95%,免疫双扩散和ELISA结果显示,宫颈癌病人血清抗体效价明显高于健康人,表明该蛋白具有良好的抗原性,小鼠免疫力试验结果表明该蛋白具有较好的免疫原性。结论电洗脱法得到的目的蛋白纯度较高,且有较好的免疫学活性。     

肺炎链球菌神经氨酸酶nanA蛋白的原核表达、纯化及其免疫保护效果

目的原核表达并纯化肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)神经氨酸酶nan A蛋白,并在小鼠模型中检测其保护效果,评价其作为S.pn疫苗候选蛋白的可行性。方法构建重组原核表达质粒p ET28a(+)-nan A,重组nan A蛋白经IPTG诱导及Ni-NTA亲和层析柱纯化后,采用黏膜(与CT佐剂混合)和腹腔(与Alum佐剂混合)给药途径免疫BALB/c小鼠,建立相应的S.pn感染模型,同时设相应对照组(佐剂+PBS),ELISA法检测特异性抗体及亚型;小鼠鼻腔滴定试验检测主动免疫保护效果;体内抗定植试验检测nan A蛋白对19F型S.pn在鼻咽部定植的保护作用。结果重组表达质粒p ET28a(+)-nan A经双酶切(NdeⅠ/XhoⅠ)及测序鉴定证明构建正确;重组蛋白的相对分子质量为55 000,主要以可溶性形式表达,约占菌体总蛋白的55%,纯化后纯度达90%;黏膜免疫组小鼠唾液中Ig A及Ig G效价分别为1.6×103和3.2×102,血清中Ig G效价为2.0×106,亚型主要为Ig G2a;腹腔免疫组血清中Ig G效价为0.5×106,亚型主要为Ig G1;黏膜和腹腔免疫小鼠生存时间较相应对照组显著延长(P0.05),黏膜免疫组小鼠生存率较其对照组显著增加;黏膜免疫可显著降低S.pn 19F在宿主鼻咽部和肺部的定植。结论原核表达并纯化了nan A蛋白,诱导的小鼠免疫反应可有效抵抗S.pn的感染,并可显著降低S.pn在宿主鼻咽部及肺部的定植,表明nan A蛋白是较理想的S.pn疫苗候选蛋白。     

泌尿道致病性大肠埃希菌PapG重组蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用

目的探讨泌尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)P菌毛粘附素PapG重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用。方法纯化蛋白按一定程序免疫BALB/c雌性小鼠,末次免疫后第7天用UPEC临床分离株进行尿道上行攻击;攻击后第5天检测尿液和肾脏培养菌,同时测定血清抗体效价。结果经GST-PapG重组蛋白和GST纯化蛋白免疫的小鼠体内均产生了相应的抗体,而仅经重组蛋白免疫的小鼠具有一定的抵抗毒株上行感染的能力,表现为肾脏培养菌量均明显减少。结论PapG粘附素与GST构成的重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用。     

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体诱导的免疫应答

目的观察鼻咽癌人源抗独特型单链抗体G22ScFv在小鼠体内诱导的免疫应答,探讨其作为鼻咽癌疫苗的可能性。方法在大肠杆菌中诱导表达G22ScFv并进行纯化,以纯化的G22ScFv免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA及竞争抑制ELISA检测免疫小鼠特异性体液免疫应答水平;流式细胞术检测免疫小鼠脾T淋巴细胞表型的变化。结果纯化的融合蛋白纯度达95%以上,且具有良好的反应原性。经ELISA检测,G22ScFv免疫后,小鼠产生了Ab3,且小鼠脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞数量升高。结论G22ScFv可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答,为鼻咽癌人源抗独特型抗体疫苗的临床应用奠定了基础。     

弓形虫可溶性速殖子抗原联合IFNγ滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)联合IFNγ滴鼻免疫BALB/c小鼠诱导的免疫应答,为研制弓形虫黏膜疫苗提供实验依据。方法将BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组以STAg(20μg/只)+IFNγ(1 000 U/只)滴鼻,对照组以PBS滴鼻。免疫2次,间隔2周。分别于初次免疫后0、2、4、6、8、10、12周处死小鼠,分离脾淋巴细胞、肠上皮内淋巴细胞(IELs)并计数;分离血清,用ELISA法测定IgA和IgG含量。结果免疫后实验组小鼠IELs和脾淋巴细胞均有增生,IELs和脾淋巴细胞数量均于初次免疫后4周达峰值,IEL数量4、6周显著高于对照组;脾淋巴细胞数量2、4周显著高于对照组。实验组小鼠血清IgG和IgA水平均于初次免疫后4周达峰值,IgG水平2、4周显著高于对照组,至12周时仍高于对照组;IgA水平4、6周显著高于对照组。结论STAg联合IFNγ滴鼻免疫BALB/c小鼠,可有效诱导黏膜及系统免疫应答,且可持续较长时间。     

旋毛虫对BALB/c小鼠体内人结肠癌HCT-8细胞的作用

目的观察旋毛虫感染对BALB/c小鼠体内人结肠癌HCT-8细胞生长的作用。方法用不同剂量的旋毛虫感染BALB/c小鼠,并在不同时间接种HCT-8细胞,荷瘤20 d后解剖小鼠,测定小鼠体内肿瘤的体积、重量,计算抑瘤率,并检测T淋巴细胞亚群。结果各实验组小鼠肿瘤体积和重量均显著低于对照组,CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、未长瘤小鼠比例、小鼠死亡率和抑瘤率均显著高于对照组;先接虫后荷瘤组抑瘤效果优于先荷瘤后接虫组。结论旋毛虫对BALB/c小鼠体内的人结肠癌HCT-8细胞的生长有一定的抑制作用。     

弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的特异性抗体动态观察

目的观察弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导的血清IgG、粪便和鼻咽冲洗液中IgA特异性抗体动态,探讨其抗弓形虫感染作用机制。方法96只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组以弓形虫复合黏膜疫苗(20μl/只)滴鼻免疫,对照组以PBS滴鼻。分别于滴鼻2次(间隔2周)后第1、2、3、4、6、8、10和12周处死小鼠,收集血清、粪便及鼻咽冲洗液,采用ELISA法检测血清IgG以及粪便和鼻咽冲洗液中IgA抗体。结果实验组小鼠血清IgG、粪便及鼻咽冲洗液中IgA均高于对照组,血清IgG水平第3周达高峰,第14、6和8周显著高于对照组;粪便IgA抗体第2周达高峰,第2、3和4周显著高于对照组;鼻咽冲洗液中IgA第1周即达高峰,之后逐渐降低,至第12周仍显著高于对照组。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导高水平的特异性抗体,且可持续较长时间。     

HIV-1病毒样颗粒的纯化及其免疫原性

目的纯化HIV-1病毒样颗粒,并检测其免疫原性。方法稳定表达HIV-1结构蛋白Gag和Env的重组293细胞经大规模培养后,收集培养上清,经30%蔗糖垫两次纯化,免疫BALB/c小鼠,Western blot检测小鼠血清中抗体水平。结果重组293细胞培养上清的纯化产物经SDS-PAGE分析,可见目的蛋白的表达。Western blot检测显示,纯化蛋白具有良好的反应原性。免疫小鼠后能够诱导产生针对目的蛋白的抗体,其抗体水平呈剂量依赖关系。结论纯化的HIV-1病毒样颗粒能够诱导小鼠产生抗体,具有良好的免疫原性。     

抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组蛋白p GEX-MIC6作为抗原免疫BALB/c小鼠,收集脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,对融合后的杂交瘤细胞进行筛选后,经腹腔注射BALB/c小鼠,制备腹水,鉴定单抗的亚类。采用辛酸-硫酸铵法结合蛋白亲和层析柱纯化腹水,SDS-PAGE分析抗体的相对分子质量,间接ELISA法检测抗体效价及特异性,BCA蛋白浓度检测试剂盒测定抗体浓度。结果最终获得两株能稳定分泌新孢子虫MIC6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A1和1H11,分泌的抗体分别属于Ig G1和Ig G2b亚类。纯化后的腹水经SDS-PAGE分析,分别可见相对分子质量约为50 000的重链和25 000的轻链条带,纯化效果较好;1A1和1H11的腹水效价分别为5.12×104和1.024×105,浓度分别为0.935和2.010 mg/ml,两株单抗均能特异性识别新孢子虫,与弓形虫无交叉反应。结论制备的抗犬新孢子虫MIC6单克隆抗体特异性较强,为进一步研究新孢子虫MIC6的生物学功能及建立特异敏感的新孢子虫检测方法奠定了基础。     

重组幽门螺旋杆菌黏附素A的可溶性表达、纯化及其免疫学性质分析

目的 通过分子克隆、蛋白表达及纯化等技术获得重组幽门螺旋杆菌黏附素A(recombinant H. pylori adhesin A,rHpaA)，免疫BALB/c小鼠，制备anti-HpaA多克隆抗体后，分析其抗体特异性。方法 利用Phyre2和DNAstar生物信息学软件分析rHpaA的三维结构及抗原性质；通过PCR长片段DNA合成技术获得黏附素HpaA基因，插入质粒pCzn1中，制备重组质粒pCzn1-rHpaA，转化E. coli Arctic Express(DE3)，经IPTG诱导表达、Ni-IDA亲和层析纯化后，获得rHpaA蛋白，Western blot鉴定其反应原性。将rHpaA辅以弗氏佐剂免疫雄性BALB/c小鼠，共6只，制备antiHpaA多克隆抗体，ELISA法鉴定其抗体特异性。结果 rHpaA具有较好的三维结构及抗原性质。双酶切鉴定及基因测序证明，重组质粒pCzn1-rHpaA含有完全正确的HpaA基因序列。重组菌株pCzn1-rHpaA/Arctic Express可溶性表达目的蛋白rHpaA，约占上清总蛋白的68.3%，纯度达98.1%。rHpaA可与an...     

小鼠载脂蛋白A-Ⅰ的原核表达及抗血清的制备

目的原核表达小鼠载脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ),并制备抗血清。方法应用RT-PCR方法从小鼠肝脏中扩增ApoA-Ⅰ基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后,免疫家兔,制备抗血清。结果扩增的ApoA-Ⅰ基因经测序,表明与GenBank中报道的序列(NM_009692)完全相同。重组表达质粒经酶切鉴定,证明构建正确。表达的ApoA-Ⅰ融合蛋白相对分子质量约为32000,表达量占菌体总蛋白的17%。纯化的融合蛋白纯度达90.7%,可与抗His·Tag单抗发生特异性反应。制备的抗血清可识别ApoA-Ⅰ融合蛋白,效价可达1∶105。结论已在大肠杆菌中表达了小鼠ApoA-Ⅰ,并制备了较高效价的抗血清。     

重组人成熟型转化生长因子β_1及其抗原表位在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性鉴定

目的研制人转化生长因子(TGF)-β1自体蛋白疫苗,并诱导小鼠产生抗人TGF-β1的中和抗体。方法将hTGF-β1及其抗原表位基因β32和β80分别克隆入pGEX-4T-1原核表达载体,并引入T细胞辅助表位(TT),转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达。应用GST亲和层析纯化重组融合蛋白,并经Westernb lot鉴定,用流式细胞术(FCM)检测抗hTGF-β1抗血清与人肝癌细胞株SMMC-7721表面膜型TGF-β1的结合状况。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清中抗hTGF-β1抗体的效价。结果成功构建了人成熟型TGF-β1及其不同表位基因片段的重组表达质粒pGEX-TT-β32、pGEX-TT-β80和pGEX-TT-hTGF-β1,表达的3种重组蛋白(GST-TT-β32、GST-TT-β80和GST-TT-hTGF-β1)经Western blot鉴定显示,同时具有hT-GF-β1和GST的抗原性。经纯化后免疫BALB/c小鼠,血清抗人TGF-β1抗体的效价均达到1∶104,其中GST-TT-β80的抗体效价最高。FCM显示3种重组蛋白免疫的小鼠抗血清均能与高表达膜型TGF-β1的人SMMC-7721结合,但重组蛋白GST-TT-β80和GST-TT-hTGF-β1免疫组抗血清的结合率明显高于GST-TT-β32组。结论构建的人成熟型TGF-β1及其不同表位片段的不同融合蛋白疫苗均能够诱导BALB/c小鼠产生抗人TGF-β1的中和抗体。     

弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的脾与肠相关淋巴组织细胞免疫效应及动态变化

目的观察弓形虫与Vero细胞共培养提取的排泄-分泌抗原(ESA)鼻内免疫BALB/c小鼠诱导的脾及肠相关淋巴组织(GALT)细胞免疫效应及动态变化。方法84只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,实验组以ESA(20μg/只)为抗原,对照组用未接种弓形虫的细胞培养上清液(20μl/只),鼻内免疫2次,间隔2周。末次滴鼻后第1、2、3、4、5、6、7周处死小鼠,分离脾、派伊尔结(PP)及小肠上皮内淋巴细胞(IEL)并计数。结果实验组小鼠脾淋巴细胞第3周达高峰,第1、2、3周明显高于对照组;PP淋巴细胞明显增生,第3周达高峰,第1、2、3、4、5周显著高于对照组;IEL第2周增生达高峰,第1～3周显著高于对照组。结论弓形虫ESA鼻内免疫BALB/c小鼠可有效诱导不同黏膜部位及系统特异性的细胞免疫应答,且可持续较长时间。