sucA缺失型大肠杆菌菌株的构建与发酵条件优化

反式-4-羟脯氨酸在多领域具有重要应用价值。为了进一步提高反式-4-羟脯氨酸的产量,在已构建好的E. coli BL21(DE3)△putA的基础上,敲除基因sucA的同时插入密码子优化后的反式-4-羟化酶基因(hyp),并将构建好的质粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb导入该基因敲除菌株中。之后在摇瓶水平上,单因素优化发酵条件与发酵培养基的组分,并通过正交实验进一步确定敲除菌株的培养条件。结果表明:与含有同样质粒的原菌和两种单敲除菌E. coli BL21(DE3)△sucA、E. coli BL21(DE3)△putA相比,E. coli BL21(DE3)△putA△sucA双敲除菌具有最高的全细胞酶活,大约是原菌的2.6倍;在摇瓶水平上,发酵条件优化后,以100 mmol/L的L-脯氨酸为底物进行发酵,12 h后可得到1.08 g/L的羟脯氨酸,是优化前的3.87倍。     

精氨酸缺陷型菌株发酵生产反式-4-羟脯氨酸

为了获得高产反式-4-羟脯氨酸的菌株,基于大肠杆菌的代谢网络模型的指导,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Δput A为出发菌株,通过基因敲除技术成功敲除arg B基因,阻断L-脯氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-脯氨酸合成的代谢流,构建了精氨酸缺陷型菌株E.coli BL21(DE3)Δput AΔarg B。同时转入表达质粒p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp,该质粒含有突变基因pro B2,该突变基因所编码的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制作用显著降低。摇瓶发酵结果表明,在外源添加600 mg/L L-精氨酸时,该重组菌株产反式-4-羟脯氨酸的量达到312.67 mg/L,较菌株E.coli BL21(DE3)Δput A/p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp提高了25.29%。     

以甘油为碳源发酵高产反式-4-羟脯氨酸菌株的选育及营养优化

以低品级甘油为碳源进行微生物发酵合成反式-4-羟脯氨酸(Trans-4-hydroxy proline,Hyp)的探索。从实验室构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/p UC19-ptrp2-Hyp出发,通过易错PCR随机突变和常压室温等离子体复合诱变处理,利用单菌落琼脂块和氨基酸显色相结合高通量筛选出1株以甘油为唯一碳源的Hyp高产菌P71。与葡萄糖培养基相比,该菌株更适合在甘油上生长并转化L-脯氨酸合成Hyp,发酵20 h产Hyp高达1.20g/L,比生长在葡萄糖培养基上高70%以上;比其出发菌株在葡萄糖培养基上产量提高了1倍以上。通过培养基成分系统优化,发现胰蛋白胨、Fe SO4和L-脯氨酸是3大主要影响因素,最适加量分别为7.01 g/L、11.51 g/L和1.41 mmol/L;在该条件下突变菌株摇瓶发酵12 h产Hyp达1.61 g/L,比优化前提高了50%。     

代谢工程改造Escherichia coli生产3-羟基丙酸

以提高3-羟基丙酸的产量为目标,对实验室构建的基因工程大肠杆菌进行改造,敲除形成副产物1,3-丙二醇的主要酶基因——乙醛脱氢酶基因yqh D,得到E.coli W3110Δyqh D(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.53 g/L,相比未敲除yqh D基因的菌株,产量提高了5.8倍。另外,敲除了甘油代谢途径中的抑制因子glpR基因,得到E.coli W3110ΔglpR(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.86 g/L,相比未敲除glpR基因的菌株,产量提高了6.7倍。后经5 L罐发酵培养后,3-羟基丙酸的产量提升到15.4 g/L。该实验为进一步利用大肠杆菌工程菌发酵生产3-羟基丙酸提供了研究基础。     

不依赖IPTG诱导产木糖醇大肠杆菌工程菌的构建

该研究采用分子生物学技术构建不依赖异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导产木糖醇的大肠杆菌（Escherichia coli）工程菌,并研究启动子、质粒拷贝数、诱导剂IPTG的添加、基因xylA和xylB的敲除以及木糖含量对工程菌发酵产木糖醇的影响。结果表明,当转速为200 r/min时,E. coli AI07/pWYZ-1（启动子为lacP）的木糖醇产量是E. coli AI07/pAGI02（启动子为pflB-p6）的1.8倍;E. coli AI07/pWYZ-2（中拷贝质粒pBR322）的木糖醇产量高于E. coli AI07/pWYZ-1（高拷贝质粒pUC19）,分别为19.56 g/L、7.90 g/L;是否添加诱导剂IPTG对E. coli AI07/pWYZ-2产木糖醇影响不大,且在发酵96 h时,木糖醇产量极显著高于E. coli AI05/pWYZ-2（P＜0.01）,其在不添加IPTG的条件下,当木糖初始质量浓度为80 g/L,发酵时间为108 h时,木糖醇产量达48.7 g/L。     

无外源脯氨酸发酵产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及发酵优化

为实现无外源脯氨酸的条件下直接从葡萄糖转化生成反式-4-羟脯氨酸,本实验采用定点突变和基因共表达的方法构建重组大肠杆菌:首先对L-脯氨酸生物合成途径中的关键酶谷氨酸激酶进行定点突变E143A、K145A,以增强L-脯氨酸生物合成能力;然后引入脯氨酸4-羟化酶基因,通过两个基因的共表达可以实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化,而不再需要添加外源L-脯氨酸。得到的L-脯氨酸生物合成能力增强的菌株在摇瓶阶段L-脯氨酸的产量可达到1.4 g/L;pro BA2与hyp双基因共表达菌株的反式-4-羟脯氨酸产量为98.9 mg/L,比原始菌株提高了一倍,经发酵优化后得到培养基为:葡萄糖10 g/L,胰蛋白胨15 g/L,硫酸亚铁3 mmol/L,硫酸镁1 g/L,磷酸氢二钾3 g/L,氯化钙0.015 g/L,在这个培养条件下反式-4-羟脯氨酸的产量为220.0 mg/L,比优化前提高1.2倍。     

电转化法制备高转化效率的E.coli感受态细胞研究

为了制备高转化效率的E.coli TG1和E.coli DH5α感受态细胞,采用电转化方法探索E.coli生长对数期的不同生长阶段、质粒DNA含量、电场强度对E.coli转化效率的影响.研究结果表明40 μL菌液中加1.0 ng pUC19 DNA,用间隙0.2 am电击杯时转化效率最高,E.coli TG1有1个电转化效率峰值,即A600为0.665时,转化效率达1.7×109cfu/μg pUC19 DNA;E.coli DH5α有2个转化效率峰值,即A600为0.443和0.810时,转化效率均为3.0×109cfu/μg pUC19DNA.研究结果表明,在相同情况下E.coli DH5α的转化效率高于E.coliTG1,利用本实验确定的参数可制备出高转化效率的电转化感受态细胞.     

固定化重组大肠杆菌产1,3-丙二醇发酵条件的研究

利用海藻酸钙将重组大肠杆菌JM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)固定化,并对影响重组菌固定化细胞发酵的营养因子进行研究。实验结果表明,该重组菌固定化细胞发酵的适宜培养基组成为:甘油80 g/L、酵母膏5.0 g/L、VB120.05 g/L以及KH2PO47.5 g/L;在此培养条件下,1,3-丙二醇产量、转化率及生产能力分别可达61.5 g/L、76.8%和2.57 g(L.h),与游离细胞相比,重组菌固定化细胞对底物甘油和产物1,3-丙二醇的耐受力明显提高,且1,3-丙二醇产量明显提高。     

乳酸乳球菌发酵生产γ-氨基丁酸的条件优化

通过对乳酸乳球菌的发酵培养基及发酵条件进行优化,得到有利十GABA产量的培养基组分为葡萄糖10g/L、混合氮15g/L、混合氮源(柠檬酸二三铵:硫酸铵)成分比例2:1、谷氨酸20g/L:有利于GABA产量的发酵条件为培养基仞始pH6.5、培养温度30℃、培养时间26h.在最佳培养基组合和发酵条件下,发酵液中GABA的产量达9.01g/L.     

转化植物甾醇产22-羟基-23, 24-双降甾-1, 4-二烯-3-酮(HPD)工程菌株的构建及发酵培养基优化

22-羟基-23, 24-双降甾-1, 4-二烯-3-酮（HPD）作为一种重要的甾体药物中间体,是合成很多皮脂类药物的原材料。通过在分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum DSM 1381）体内过表达3-甾酮-Δ1脱氢酶（KstD）基因,Mycobacterium neoaurum DSM 1381Z菌株发酵液中HPD的产量由71%提高到84%。在单因素选择的基础上,以产物HPD的产量作为衡量指标,利用响应面方法优化发酵培养基,建立各个因素之间变化的二次回归方程。结果表明,最合适的发酵培养基组成条件是玉米浆9 g/L、硝酸钠1.8 g/L、葡萄糖6 g/L、磷酸氢二钾2 g/L。此条件下5 g/L的植物甾醇,HPD的产量可达3.73 g/L,HPD的产量比原始菌株提高了大约2.7倍,具备潜在的工业化应用价值。     

In-vitro and in-vivo antioxidant effects of the oyster mushroom Pleurotus ostreatus

Although almost all organisms are equipped with antioxidant defense and repair systems that have evolved to protect them against oxidative damage, these systems are often inadequate to completely prevent oxidative stress-induced damage. Therefore, antioxidant supplements, or natural products containing antioxidants, may be used to help reduce oxidative damage to the human body. Mushrooms have been part of the normal human diet for thousands of years and, in recent times, the amounts consumed have risen greatly, involving a large number of species. The genus Pleurotus comprises 40 different species that are commonly referred to as “oyster mushrooms”. It has been shown to possess cholesterol-lowering, anti-tumor, antiviral, anti-thrombotic and immunomodulating effects. Pleurotus ostreatus contains higher concentrations of cystine, methionine and aspartic acid than other edible mushrooms, such as Agaricus bisporus (brown), A. bisporus (white) and Lentinus edodes. Until now, research has tended to focus on the dietary value of edible mushrooms; however, there is relatively little information pertaining to the antioxidant activity and the possible use of such mushrooms to neutralize oxidative stress. Hence, the aim of the present review was to summarize the in-vitro and in-vivo antioxidant effects of the mushroom P. ostreatus.     

Anti-inflammatory effects of Punica granatum Linne in vitro and in vivo

Inflammation can cause various physical dysfunctions. Punica granatum Linne (pomegranate), a high phenolic content fruit, is widely used as an antipyretic analgesic in Chinese culture. Pomegranate has shown potential nitric oxide (NO) inhibition in LPS-induced RAW 264.7 macrophage cells. Moreover, pomegranate (100 mg/kg) significantly decreased carrageenan-induced mice paw edema for 1, 3, 4, and 5 h. Therefore, column chromatography combined with in vitro bioassay-guided fractionation was used to isolate the active anti-inflammatory components from the pomegranate. Punicalagin (1), punicalin (2), strictinin A (3), and granatin B (4) were obtained with yields of 0.093%, 0.015%, 0.003%, and 0.013%, respectively. All these hydrolysable tannins inhibited NO production and iNOS expression in RAW 264.7 cells. Among them, 4 showed the strongest iNOS and COX-2 inhibitory effects, and exhibited these effects in the inhibition of paw swelling and the PGE₂ level in carrageenan-induced mice. Taken together, we suggest that 4 could be used as a standard marker for the anti-inflammatory effect of pomegranate.     

不同低聚糖对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌作用的体外研究

为更好地了解功能性低聚糖对口腔微生物的影响,本文采用体外实验方法,研究不同低聚糖对变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌生长、产酸、粘附性和生物被膜形成量等的影响。胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticase Soy Broth,TSB）培养基中加入不同浓度的低聚半乳糖、低聚木糖、低聚果糖和低聚异麦芽糖制备培养基培养变异链球菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌,测定细菌在培养基中48 h生长过程中的OD值、pH、黏附能力及生物被膜形成量等指标。比较分析不同低聚糖对细菌发酵前后生长、产酸及黏附能力等特性的影响。结果表明:四种低聚糖对三种病原菌均有不同程度的抑制作用。其中,低聚木糖对三种病原菌的生长抑制效果最强;浓度为0.5%的低聚木糖和低聚半乳糖即能明显抑制三种菌液的产酸能力;相比糖醇和其它低聚糖,低聚木糖浓度≥5%时,对三种病原菌的抑制率均大于60%;7%浓度的四种低聚糖对三种病原菌的黏附率均<50%;低聚半乳糖和低聚木糖浓度>5%时,对三种病原菌生物被膜的形成具有较好的抑制作用。与山梨糖醇相比,复配糖（低聚木糖、木糖醇、低聚半乳糖）对三种病原菌的生长抑制作用更为明显。     

普通烟草Aux/IAA转录因子家族全基因组鉴定分析

Aux/IAA是一种生长素早期响应因子,影响生长素对植物生长发育的调控。烟草作为一种模式植物,在烟草中鉴定Aux/IAA家族基因对于研究生长素调控机制具有重要意义。本研究利用生物信息学方法,从普通烟草基因组中鉴定出77个Aux/IAA家族基因,平均氨基酸数为379,全部为亲水性蛋白,大部分为酸性蛋白。其中46个基因定位到19条连锁群上,分布最多的22号连锁群上有6个基因,其余31个基因位于Scafford上,所有基因均定位于细胞核内。Aux/IAA家族划分为2个类群,10个亚群,包括6对直系同源和40对旁系同源姐妹对,每个亚群中都分布有烟草的Aux/IAA基因。所有的烟草Aux/IAA基因均缺失了结构域Ⅰ,68个基因同时包含Aux/IAA结构域Ⅲ和Ⅳ,21个B6亚组基因包含B3、ARF和Aux/IAA结构域。内含子-外显子结构除了B6亚组基因外,都较为简单。表达模式分析结果显示,不同亚群的基因组织表达特异性不同,同一亚群的基因组织表达特异性一致。Aux/IAA家族基因主要参与细胞组成、蛋白结合、生物进程调节、信号转导、刺激反应、代谢过程等功能。      

中国被毛孢分离鉴定及其PKS、NRPS功能基因的多样性

探究中国被毛孢(Ophiocordyceps sinensis)遗传、聚酮合成酶(Polyketide synthase,PKS)、非核糖体多肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthase,NRPS)的多样性,为寻找合成生物活性物质的潜在菌株奠定基础。采用组织分离法从冬虫夏草中分离获得一株具有较强抑菌活性的真菌ZG4-23,采用多基因系统分析的方法对该菌株进行鉴定;利用兼并性引物对菌株ZG4-23的PKS基因和NRPS基因进行PCR扩增及序列测定分析,构建系统发育树,明确菌株ZG4-23的PKS基因序列和NRPS基因序列的系统进化地位。结果表明,多基因序列分析显示,菌株ZG4-23与多个中国被毛孢菌株同源性高达99%,因此确定该菌株为中国被毛孢(O. sinensis)。菌株基因组含有PKS I、NRPS 基因,经比对,PKS I片段与已知Ophiocordyceps sinensis PKS序列相似度为99%,NRPS片段与Trichophyton rubrum NRPS序列相似度为76%。中国被毛孢具有较强合成生物活性次生代谢产物的潜在能力,值得进一步开发研究和应用。     

Antioxidative constituents ofRosmarinus officinalis andSalvia officinalis

Summary The strong antioxidative activity ofRosmarinus officinalis andSalvia officinalis is caused by phenolic diterpenes. Extracts of these herbs are used as additives to stabilize fat and fat-containing foodstuffs against oxidation. To determine the concentration of individual phenolic diterpenes in pure extracts and fats an HPLC method with electrochemical detection has been developed.

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Antioxidativ wirksame Inhaltsstoffe ausRosmarinus officinalis undSalvia officinalis neben Tocochromanolen mittels HPLCI. Bestimmung von antioxidativ wirksamen phenolischen Diterpenen

Zusammenfassung Die hohe antioxidative Wirksamkeit vonRosmarinus officinalis undSalvia officinalis läßt sich auf phenolische Diterpene zurückführen. In Form von Extrakten können sie Fetten und fetthaltigen Lebensmitteln zum Schutz vor oxidativen Veränderungen zugesetzt werden. Um ihre Konzentration in Extrakten selbst sowie in Fetten zu bestimmen, wurde eine HPLC-Methode mit elektrochemischer Detektion entwickelt.

     

植物乳杆菌发酵对蕨菜品质的影响

以新鲜野生蕨菜为原料,接种植物乳杆菌Z17（Lactobacillus plantarum Z17）进行发酵,并以自然发酵为对照,于相同条件下发酵42 d,探究发酵过程中接种植物乳杆菌Z17对蕨菜的总酸、还原糖、pH、色度、褐变指数、咀嚼性以及黏性等理化指的影响。结果表明:接种Z17后蕨菜的pH下降速率以及还原糖含量提升的速率明显优于自然发酵;发酵过程中总酸的含量也得到了显著的提升（P<0.05）,尤其是乳酸,含量提升了2.3倍;发酵结束后,接种Z17的蕨菜与自然发酵蕨菜感官评价分别为（88.34±3.74）和（65.23±2.68),接种Z17明显提升了蕨菜的咀嚼性和硬度。综上可知,接种植物乳杆菌能够有效地缩短发酵周期、提高泡菜食用性,还有利于改善发酵蕨菜的品质。     

Some properties of the polygalacturonase from four Zimbabwean wild fruits (Uapaca kirkiana, Zizphus mauritiana, Tamarindus indica and Berchemia discolor fruits)

Polygalacturonase was extracted from ripe Uapaca kirkiana, Zizphus mauritiana, Tamarindus indica and Berchemia discolor fruits of Zimbabwe. Protein concentrations and activities of the enzymes in the extracts were determined in the four fruit extracts. The protein concentrations in the enzyme extracts ranged from 0.82 ± 0.17 to 1.97 ± 0.13 mg/ml and enzyme activities from 1.99 ± 0.13 to 6.64 ± 0.38 mmol min⁻¹ mg⁻¹ in the four fruit extracts. Optimum pH of the enzyme ranged from 4.5 to 5 and optimum temperature from 25 to 37 °C. The enzyme extracts reduced the viscosity of 1% pectin solutions in an experiment which was done together with assay for reducing sugars to prove the activities of the enzyme extracts in the four wild fruits. The K_m and V_max ranged from 0.115 to 0.252 mg/ml and 0.0057 to 0.0119 mmol reducing groups/min/mg protein, respectively, in the four polygalacturonase extracts. Calcium chloride and sodium chloride activated the PG from all sources to a greater extend than magnesium chloride and barium chloride. PG from the other three fruits had very little effect on the polysaccharide from U. kirkiana.     

Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph在毕赤酵母中的表达及重组酶酶学性质

将Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因sph进行毕赤酵母密码子优化后,进行全基因合成,并构建了重组酵母菌P. pastoris X33-ppicZalphA-sph,对重组酶进行酶学性质研究。结果表明,重组酶的最适反应温度和最适反应pH为40 ℃和8.0,且其为20~30 ℃中保温10 h仍有80%以上的酶活力、在pH7.0~9.0条件下孵育24 h,仍能保持60%以上的酶活性。K+、Sr2+对酶活有明显激活作用,而Fe3+、Ba2+对酶活有明显抑制作用;重组蛋白酶SPH在极性常数为0.8~3.1的25%的正丁醇、环己烷、二甲苯中孵育6 d后,仍能保留50%以上的酶活性。本研究为B. phaericus 2297和B. phaericus DS11蛋白酶有机溶剂耐受性机制的研究奠定基础。     

岷江百合与兰州百合鳞茎中多酚组分及其生物活性

为研究百合的抗氧化和抑菌活性,以野生岷江百合和兰州百合为材料,采用比色法、高效液相色谱法(HPLC)和比浊法对其鳞茎中总多酚、黄酮、黄烷醇、单体酚组分及含量、抗氧化能力和抑菌活性进行分析。结果表明:两种百合鳞茎中均富含多酚但种间存在显著差异(p<0.05),岷江百合鳞茎中总多酚、黄酮和黄烷醇的含量分别是兰州百合含量的2.07、2.25、3.16倍;在两种百合鳞茎中检测出14种单体酚,其中原矢车菊素B2含量最高,在岷江百合和兰州百合中分别达到了37.60、20.60 mg·kg-1,除没食子酸外,岷江百合鳞茎中其他被检测出的单体酚含量是兰州百合的1.43~41.84倍;两种百合鳞茎多酚提取物均具有一定的抗氧化和抑菌活性,且岷江百合的抗氧化和抑菌活性均显著高于兰州百合(p<0.05),是兰州百合的1.40~14.40倍。野生岷江百合鳞茎多酚提取物具有抗氧化和抑菌双重作用,可作为天然抗氧化剂、抗菌药物应用于食品和医药业,具有良好的开发应用前景。