重组人干扰素βSer~(17)的结构及活性分析

目的分析大肠杆菌表达的重组人干扰素βSer17(rhIFN-Ser17)的分子结构及其生物学活性。方法通过West-ernblot、氨基酸末端测序、质谱及生物学活性分析等,对大肠杆菌表达的rhIFN-Ser17分子进行鉴定。结果大肠杆菌表达的rhIFN-βSer17的N末端20个氨基酸及C端2个氨基酸序列与文献报道一致,产物的相对分子质量为19877·9,比活性超过2×107IU/mg蛋白。结论大肠杆菌表达的rhIFN-βSer17分子结构与理论推测值完全一致。     

疏水层析在去除复合干扰素聚集体中的应用

<正>干扰素(interferon,IFN)是一种具有广泛生物活性的调节蛋白质,临床上主要用于抑制病毒的增殖。重组复合干扰素(consensus interferon,cIFN)是一种完全由人工设计的重组干扰素,是通过对14种天然亚型IFN序列的扫描,利用重组DNA技术,将这些亚型IFN蛋白质结构中每一位点上最常见的氨基酸序列排列成一复合序列,再通过基因重组技术在大     

重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性分析

目的对在大肠杆菌中表达的重组人肝再生增强因子(rhALR)进行分离纯化及生物学活性分析。方法以大肠杆菌DH5α发酵表达重组人肝再生增强因子,经包涵体洗涤、变性、目的蛋白复性,以离子交换、分子筛等技术纯化,并进行一系列检定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及柱层析纯化,纯度大于98%,SDS-PAGE测定相对分子质量为30000,MOLDI-TOF-MS测定其相对分子质量为30780·522,N-末端15个氨基酸与理论序列一致。Western blot证实rhALR正确表达,等电点5·85~6·85,氨基酸含量与理论值基本符合。动物实验证实rhALR具有明显的促进CCl4毒性肝损伤小鼠肝细胞修复活性。结论经柱层析纯化的rhALR具有促进小鼠CCl4肝损伤肝细胞修复的活性。     

猪γ干扰素基因的合成、表达及纯化

目的通过人工合成猪γ干扰素(poIFN-γ)基因的编码序列,提高目的蛋白的表达。方法根据poIFN-γ的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏爱的密码子,设计并合成了24个寡核苷酸片段。通过重叠区扩增法,利用PCR合成poIFN-的成熟蛋白编码基因,克隆入pGEM-7Zf(+)载体,转化大肠杆菌TG1。经测序证实后,构建原核表达载体pBV222/poIFN-γ并转化大肠杆菌DH5α,经诱导表达后,进行SDS-PAGE分析及纯化。结果酶切及测序结果表明表达载体构建成功,工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子质量约16500的位置出现明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的55%,占包涵体中总蛋白的80%,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,纯度达90%以上。结论已获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪γ干扰素进行复性及活性研究奠定了基础。     

重组人血清白蛋白-干扰素β融合蛋白的分离纯化及质控方法的建立

目的建立中试制备重组人血清白蛋白-干扰素β(Recombinant human serum albumin-interferonβ,rHSA-IFNβ)融合蛋白的纯化工艺及质控方法。方法采用50 L发酵罐诱导表达rHSA-IFNβ融合蛋白,发酵液经超滤浓缩及脱盐后,再经BlueSepharose FF亲和层析、G25凝胶过滤层析和SP Sepharose FF阳离子交换层析纯化。SDS-PAGE(银染法)和HPLC测定融合蛋白纯度,Western blot分析反应原性,质谱法测定相对分子质量,Edman降解法测定N-末端氨基酸序列,等电聚焦电泳法测定等电点,细胞病变抑制法测定rHSA-IFNβ融合蛋白的生物学活性,其余检测项目均按《中国药典》三部(2010版)要求进行。结果纯化的3批融合蛋白纯度可达96%以上,具有人血清白蛋白和人干扰素β的双重反应原性,相对分子质量分别为89 070、89 035和88 669,N-末端氨基酸序列为:NH2-D-A-H-K-S,等电点为6.34,比活性分别为1.9×106、1.5×106和1.1×106IU/mg,其余各项指标均符合要求。结论已成功建立了中试制备rHSA-IFNβ融合蛋白的纯化工艺及质控方法。     

及鉴定

目的研制基因工程胰高血糖素,用于治疗因注射胰岛素或口服抗糖尿病药物而引起的严重低血糖反应.方法依据人胰高血糖素氨基酸组成序列,采用大肠杆菌出现频率高的氨基酸密码子,体外合成胰高血糖素基因序列,克隆于pGEX-1N质粒,转化入BL21(DE3)菌中,对阳性克隆转化质粒进行DNA测序.用IPTG诱导转化的胰高血糖素工程菌,产生谷胱苷肽转移酶的融合蛋白,经谷胱苷肽Sepharose4B亲和层析后,由FactorXa酶进行柱上切割,最后用RP-HPLC得到纯化产物.产品用质谱法测相对分子质量,并对N末端15个氨基酸测序.结果DNA测序显示克隆基因序列正确,产品相对分子质量为3486,N末端15个氨基酸序列与理论值相同,产率为1.9mg/L.结论获得以可溶性融合蛋白方式表达的胰高血糖素基因工程菌,适于快速生产天然序列重组胰高血糖素.     

聚乙二醇化重组人干扰素α2b的质量检测

目的　建立聚乙二醇化重组人干扰素α2b(PEG rhIFNα2b)的质量检测方法。方法　采用Wish细胞 VSV病毒系统 ,以CPE法测定干扰素的生物学活性 ,基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,反向高效液相法 (RP HPLC)测定纯度 ,溴化氰裂解 SDS PAGE法测定肽图 ,等电聚焦电泳法测定等电点 ,紫外分光光度法测定紫外吸收光谱。结果　聚乙二醇化重组人干扰素α2b的比活为 6 . 0× 10 6～ 10 . 0× 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量约为 6 2 6 0 0 ,等电点在 5 . 2 0～ 6. 5 5之间 ,紫外最大吸收峰约在 2 78nm波长处。结论　所建立的检测方法可控制聚乙二醇化重组人干扰素α2b质量。     

人蛋白C cDNA突变体的设计、克隆与序列分析

目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

牛干扰素γ蛋白在Vero细胞中的表达及其抗病毒活性

目的在Vero细胞中表达牛干扰素γ基因,并对其抗病毒活性进行鉴定。方法将牛干扰素γ全基因克隆至pcDNA3.1(+)载体,构建重组表达质粒,经PCR及双酶切鉴定,将鉴定正确的阳性质粒通过脂质体法转染Vero细胞,分别采用间接免疫荧光和Western blot法检测细胞转染效率和干扰素γ蛋白的表达,采用细胞病变抑制试验检测其抗病毒活性。结果间接免疫荧光显示绿色荧光,表明牛干扰素γ蛋白在Vero细胞中得到表达,转染效率约为50%;Western blot检测可见相对分子质量约为22 000的目的条带,进一步验证了该蛋白的表达;细胞病变抑制试验显示细胞病变明显减少,表明表达的干扰素γ蛋白具有明显的抗病毒活性。结论成功在Vero细胞中表达了牛干扰素γ蛋白,其具有明显的抗病毒作用。     

胰高血糖素基因克隆、表达及鉴定

目的 研制基因工程胰高血糖素,用于治疗因注射胰岛素或口服抗糖尿病药物而引起的严重低血 糖反应。方法 依据人胰高血糖素氨基酸组成序列,采用大肠杆菌出现频率高的氨基酸密码子,体外合成胰高血 糖素基因序列,克隆于ｐＧＥＸ－１Ｎ质粒,转化人ＢＬ２１（ＤＥ３）菌中,对阳性克隆转化质粒进行ＤＮＡ测序。用ＩＰＴＧ诱导 转化的胰高血糖素工程菌,产生谷胱苷肽转移酶的融合蛋白,经谷胱苷肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析后,由 Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ酶 进行柱上切割,最后用ＲＰ－ＨＰＬＣ得到纯化产物。产品用质谱法测相对分子质量,并对Ｎ末端１５个氨基酸测序。 结果ＤＮＡ测序显示克隆基因序列正确,产品相对分子质量为３４８６Ｊ末端１５个氨基酸序列与理论值相同,产率为 １．９ｍｇ／Ｌ。结论 获得以可溶性融合蛋白方式表达的胰高血糖素基因工程菌,适于快速生产天然序列重组胰高血 糖素。     

重组人生长激素的分离纯化及其结构确证

目的对重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rh GH)进行分离纯化,并进行结构确证。方法取rh GH工程菌菌体,进行初步纯化(低渗抽提法、盐析法)及层析纯化(Sephadex G-25分子排阻层析、DEAESephadex.F.F离子交换层析、Phenyl-Sepharose.F.F疏水层析、Phenyl S-100HR分子排阻层析),收集纯化产物,进行15%SDS-PAGE分析、相关蛋白含量检测、高分子蛋白含量检测,并进行分子量检测、氨基酸组成分析、N-末端氨基酸序列分析、C-末端氨基酸序列分析和等电聚焦电泳。结果纯化产物的相对分子质量22 125,纯度可达99.5%以上,rh GH蛋白总收率为13.36%,相关蛋白含量为1.55%,高分子蛋白含量低于0.1%;相对分子质量、氨基酸组成、N-末端氨基酸序列、C-末端氨基酸序列及等电点等均与rh GH国际标准品一致。结论纯化后获得了高纯度的rh GH蛋白,该纯化工艺简单、高效,为本产品的工业化生产奠定了基础。     

重组人Tau蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 重组人Tau蛋白的诱导表达和纯化。方法 将携带 Tau蛋白基因的工程菌株经IPTG诱导表达后,通过超声破碎、硫酸按盐析、离子交换层析、电洗脱等方法纯化Tau蛋白,以SDS-PAGE、非变性PAGE、Westem blot和N末端氨基酸测定等方法进行鉴定。结果 纯化Tau蛋白的得率为28.5％,在SDS-PAGE和非变性PAGE上呈均一的蛋白条带,其相对分子质量约为59000,N末端5个氨基酸测定结果为NH2-Met-Ala-Glu-Pro-Arg-。结论 本实验采用纯化重组人Tau蛋白方法是可行的。     

长效干扰素质控方法的研究

目的　研究和确定新型长效干扰素制品质量控制方法。方法　采用Wish细胞 VSV病毒系统测定干扰素的生物活性 ,采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,采用毛细管等电聚焦法测定样品的等电点 ,应用胰蛋白酶消化法测定肽图。结果　确定了长效干扰素制品的质控方法 ,应用该方法测定 3批长效干扰素比活性为 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量为 6 30 5 7,等电点为 5 .6。结论　建立的质控方法可以有效地控制长效干扰素的制品质量。     

固定化基因工程菌的培养和hEGF表达

引　言人表皮生长因子 (humanepidermalgrowthfactor,hEGF)是由 5 3个氨基酸残基组成、相对分子质量为 6 0 4 5的单链多肽[1] .hEGF具有多种生物活性 ,并在医药、化妆品工业中具有广泛用途 .国内外已有很多重组表达hEGF的报道[2 ,3] .但是 ,各种hEGF表达系统的质粒稳定性随培养     

重组人生长激素的原核分泌表达及其活性分析

目的构建重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)分泌表达质粒,进行原核表达,并分析其活性。方法人工合成包含phoA启动子、STⅡ信号肽序列及hGH基因优化序列的目的基因,与pBR322载体连接,构建重组克隆质粒pBR322-hGH;再将目的基因亚克隆至pACYC184载体,构建重组表达质粒pAC-hGH,进行酶切鉴定及测序分析。将鉴定正确的重组表达质粒pAC-hGH转化至感受态大肠埃希菌W3110中,构建重组工程菌,经诱导表达后进行DEAE-Sepharose FF纯化,纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻色谱、N-末端氨基酸序列及活性分析。结果重组表达质粒经酶切及测序鉴定,构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析可见相对分子质量约22 000的目的条带,菌体相对表达量达30%以上;纯化产物电泳纯度达95%以上,分子排阻色谱保留时间及N-末端15个氨基酸均与国家标准品一致,比活性大于3.0 IU/mg。结论成功构建了分泌表达rhGH的重组质粒,且获得了纯度及活性均较高的rhGH,为其产品的开发奠定了基础。     

重组人血管内皮生长因子抑制剂理化对照品质控方法及质量标准的建立

目的建立重组人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制剂理化对照品质控方法及质量标准。方法利用HEK293细胞增殖抑制法测定重组人VEGF抑制剂理化对照品生物学活性;紫外分光光度法测定蛋白含量;质谱法进行相对分子质量测定、液质肽图及糖基化位点分析、二硫键分析、N-寡糖糖型及比例分析;SDS-PAGE及SEC-HPLC法分析纯度;等点聚焦法进行电荷异质性分析;Edman降解法进行N-末端氨基酸序列分析。结果重组人VEGF抑制剂理化对照品各项检定指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立的质控方法和质量标准符合理化对照品的相关规定,具有保证该理化对照品结构正确、质量可控的特点。检定合格的理化对照品可用于该类产品的常规检定。     

人IL-10 cDNA克隆、表达及其生物学活性

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10(Human Interleukin,hIL-10)。方法 用RT-PCR自白血病细胞株K562 RNA扩增hIL-10 cDNA片段(约500bp),克隆至质粒载体pSK(+),并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRI和 BamHI消化pSK/IL-10重组质粒,分离hIL-10片段,并插入原核表达载体pBV220的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pBV/IL-10。转化菌株经42℃诱导,用SDS-PAGE和Westem blot鉴定表达的重组蛋白。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测其对外周血单核细胞(PBMC)合成IFN-γ的抑制作用。结果 RT-PCR扩增的DNA片段与hIL-10 cDNA大小一致。重组质粒pSK/IL-10的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hIL-10 cDNA序列一致。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为18000,其表达量达菌体总蛋白的20％左右。Westem blot分析显示,重组蛋白能特异性地与抗hIL-10抗体结合,复性的重组蛋白能明显抑制PBMC合成IFN-γ。结论 已成功地构建了表达具有生物学活性的重组hIL-10(Recombinant hIL-10,rhIL-10)的工程菌株。     

集成干扰素突变体的构建、表达及纯化

目的构建高效且可供单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-MAL)定点修饰的集成干扰素突变体(IIFNm108),并进行表达、纯化及鉴定。方法采用同源序列对比、空间结构模拟并结合α干扰素与受体结合的特点设计突变位点。用重叠延伸PCR法,扩增IIFNm108基因,与pET-23b载体连接,构建重组表达质粒pET-23b-IIFNm108,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,所得包涵体经变性、复性、DEAE阴离子交换及凝胶过滤两步层析纯化后,进行各项鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确。目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的30%以上,主要以包涵体形式存在。纯化的IIFNm108蛋白纯度大于95%,比活性约为(2.08±0.17)×108IU/mg,N-端、C-端氨基酸序列与理论一致,相对分子质量为19500,可与mPEG-MAL成功交联。结论已获得一种高效且可供mPEG-MAL定点修饰的集成干扰素突变体IIFNm108。     

重组抗体的N-端氨基酸序列测定

目的建立具有焦谷氨酸封闭N-端的重组抗体N-端氨基酸序列分析方法。方法利用高温稳定的焦谷氨酸肽酶,在重组人源抗狂犬病病毒单抗样品高温变性条件下,去除其N-端焦谷氨酸封闭。经还原SDS-PAGE和电印迹后,进行N-端氨基酸序列测定,并与电印迹后在PVDF膜上去封闭处理效果进行比较。结果用该方法去封闭后的抗体样品N-端焦谷氨酸去除效果较好,可顺利进行N-端氨基酸序列测定;而电印迹后在PVDF膜上去封闭处理,N-端焦谷氨酸不能充分去除,无法进行N-端氨基酸序列测定。结论该方法适于具有焦谷氨酸封闭N-端的单抗的N-端氨基酸序列分析。     

重组人白细胞介素-12(CHO细胞)的纯化及其活性

目的建立CHO细胞表达的重组人白细胞介素-12(rhIL-12)的纯化工艺,并检测纯化的rhIL-12的生物活性。方法取高效表达rhIL-12的CHO工程细胞培养上清液,采用层析结合硫酸铵沉淀的方法进行分离纯化,ELISA法测定目的蛋白的含量,并计算回收率;SDS-PAGE、SEC-HPLC和Westernblot对纯化样品进行鉴定;以PBMCIFNγ诱生法检测纯化rhIL-12的生物活性。结果纯化的rhIL-12的总回收率为56.4%;经SEC-HPLC检测,其纯度达99.2%;SDS-PAGE分析显示,两个亚基的相对分子质量分别与理论值(40000和35000)相符;Westernblot分析显示,rhIL-12可与相应抗体发生特异性结合;rhIL-12诱生IFNγ量与rhIL-12浓度呈典型的S型曲线关系,具有剂量依赖性,其效价为8.3×106IU/mg。结论已建立了CHO细胞表达的rhIL-12纯化工艺,该工艺成本低,操作简便,纯化产物回收率和纯度高,适于工业化生产。