常压室温等离子诱变选育L-天冬酰胺酶高产重组菌

以Bacillus subtilis WB600为宿主,构建了能分泌表达L-ASNase的重组菌,并通过常压室温等离子体诱变进一步提高了重组菌的产酶量。重组Bacillus subtilis WB600(p MA5-wap Aans Z)发酵30 h,胞外酶活达到37.2 U/m L,表明L-ASNase在信号肽wap A介导下能分泌至胞外。在功率120 W、气流量10 L/min、诱变时间40 s的诱变操作条件下,对重组菌进行了等离子体诱变。突变株的酶活最高达48.4 U/m L,较诱变前提高30%。上述结果表明,常压室温等离子体诱变能有效提高重组菌产L-ASNase的酶活.研究结果为L-ASNase的工业化生产提供了高效的生产菌株。     

脱乙酰基酶在枯草芽孢杆菌中的高效可溶性表达

为提高脱乙酰基酶的可溶性表达含量,对前期挖掘的脱乙酰基酶NAP-Das2. 3基因进行异源表达及发酵优化。将脱乙酰基酶NAP-Das2. 3基因克隆至枯草芽孢杆菌表达载体p P43NMK的npr B信号肽下游,转入B.subtilis WB800构建了重组工程菌B. subtilis WB800/p P43NMK/nap-das2. 3,并对重组菌培养及发酵产酶条件进行了优化。重组菌最适培养和产酶条件分别为甘油6 g/L、牛肉膏30 g/L、Na Cl 10 g/L; p H 7. 5、培养温度37℃、装液量100 m L (500 m L摇瓶)、培养30 h。在优化的条件下,发酵液中脱乙酰基酶酶活达到106. 42 U/L,较出发条件提高了424. 68倍,在5 L发酵罐培养30 h后,脱乙酰基酶酶活达到116. 13 U/L。研究实现了脱乙酰基酶的异源高效可溶性表达,为脱乙酰基酶的应用提供了基础。     

重组蔗糖异构酶的制备及应用条件优化

对重组菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-24a-pal I摇瓶发酵产酶进行研究,探讨了3 L发酵罐中不同乳糖诱导浓度对菌体高密度发酵产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵得到胞外上清酶活253.1 U/m L,3 L发酵罐高密度发酵时,在0.4 g/(L·h)乳糖诱导浓度下,发酵上清酶活可达到最大值654 U/m L。对重组蔗糖异构酶转化蔗糖生成异麦芽酮糖的酶转化条件进行了优化,结果表明,当底物浓度为400 g/L,反应初始p H 6.5,温度30℃,加酶量20 U/g蔗糖,转化时间8 h,异麦芽酮糖可以达到最大转化率87.9%。     

金属离子协同氨基酸提高重组β-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的表达

随着环糊精的应用越来越广,其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.19,简称CGT酶)已成为研究热点。为了克服天然菌种产环糊精葡萄糖基转移酶(CGT)能力低等缺陷,该文将来源于Bacillus circulans STB01的β-CGT酶基因插入质粒p ST中,构建了分泌型表达载体cgt/p ST并在宿主B.subtilis WB600中成功表达;通过对摇瓶发酵产CGT酶的条件进行优化发现,当发酵培养基为TB,p H为7.0时,37℃培养48 h后胞外酶活力达到27.9 U/m L,与天然菌株B.circulans STB01在较优发酵条件下所分泌的胞外酶活力相比,提高了近19倍;对TB培养基碳源、氮源进一步优化,以6 g/L的玉米淀粉替代TB培养基中的甘油,以30 g/L的酵母提取物作为氮源,胞外酶活可达到31.2 U/m L;亮氨酸、天冬氨酸的添加能明显促进β-CGT酶的胞外表达,而0.5mmol/L Fe3+的添加能进一步将胞外酶活提高到36.9 U/m L。这是目前报道的β-CGT酶在B.subtilis中胞外表达的最高β-环化活力。     

中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其发酵条件优化

以枯草芽孢杆菌为表达系统,以中温α-淀粉酶为目标蛋白,研究了启动子和信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。分别选取了4种启动子以及8种信号肽来进行筛选,结果表明,启动子PApr E的强度最高,信号肽SPnpr E的分泌效率最好。针对重组菌株1A751Q31进行系统的发酵优化,在72 h发酵液中α-淀粉酶酶活达到380U/m L。在7.5 L发酵罐中进行放大实验,发酵液中α-淀粉酶酶活最高达到853 U/m L。以上研究表明,α-淀粉酶适合在枯草芽孢杆菌中进行表达,同时表明枯草芽孢杆菌是良好的异源蛋白表达系统。     

基于角质酶共表达策略的大肠杆菌胞外生产耐高温α-淀粉酶及其发酵条件优化

在前期工作中通过分子改造提高了来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶在高温酸性条件下的稳定性,同时改良了催化效率。为了实现α-淀粉酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的胞外高效表达,作者尝试采用共表达嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶来增强大肠杆菌膜透性,同时优化诱导策略以提高重组α-淀粉酶的胞外表达。首先构建了能同时表达角质酶和α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pETDuet-amy-cutinase,并将此菌株与能单独表达α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pET-20b-amy进行摇瓶和3 L发酵罐的产酶发酵对比。结果显示,共表达菌株在胞外产酶方面具有明显的优势。进一步对共表达菌株的诱导条件进行优化,在32℃、诱导剂为0.15μmol/L IPTG与0.5 g/(L·h)乳糖条件下,发酵32 h后胞外α-淀粉酶最高酶活力可达6.05×10~4U/m L,是单表达菌株摇瓶发酵水平的28.3倍。此时胞外重组α-淀粉酶质量浓度为8.92 g/L,重组蛋白质的分泌效率为93.2%。     

重组大肠杆菌产Bacillus subtilis 168来源γ-谷氨酰转肽酶的摇瓶发酵优化

为实现来源于Bacillus subtilis的γ-谷氨酰转肽酶(GGT)高效胞外分泌表达,以基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-20b(+)/ggt为出发菌株,对其发酵产酶的诱导条件和培养基进行优化。最终确定其最优发酵培养基为:10 g/L甘油,21 g/L酵母粉,7 g/L蛋白胨,130 mmol/L磷酸盐;发酵条件为:37℃、200 r/min培养4 h,加入0.2 mmol/L IPTG后转入25℃,诱导40~48 h,优化后酶活达到81.2 U/m L,是未优化前的1.9倍。本研究结果为目前国内报道大肠杆菌摇瓶发酵产γ-谷氨酰转肽酶的最高酶活,为该酶的工业化生产奠定了基础。     

Bacillus stearothermophilus麦芽糖淀粉酶在Bacillus subtilis中的重组表达及发酵优化

为了实现Bacillus stearothermophilus嗜热脂肪芽孢杆菌来源的麦芽糖淀粉酶基因amyM(EC 3.2.1.133)在枯草芽孢杆菌中的重组表达,以opt-amyM/T质粒为模板进行PCR扩增得到目的基因,与表达载体pHY300PLK进行重组连接后转入宿主菌Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中进行表达。在TB培养基中发酵培养48 h,麦芽糖淀粉酶酶活达到250.7 U/mL。继续对重组菌氮源种类及复配、氮源质量浓度、碳源质量浓度等摇瓶发酵条件进行优化,确定其最佳产酶条件为:复合氮源为酵母浸膏25 g/L和大豆蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、培养基初始pH 6.5、最适培养温度41℃;在此条件下麦芽糖淀粉酶酶活可达396.7 U/mL,是优化前的1.6倍。在此基础上进一步对麦芽糖淀粉酶进行酶学性质进行测定:麦芽糖淀粉酶最适温度为60℃,最适pH为5.5,半衰期为325 h,Km为0.95 g/L,比活为2646 U/mg。     

两阶段温度控制策略以及助剂促进淀粉分支酶的胞外表达

为了促进重组淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600)中的胞外表达,对重组淀粉分支酶在摇瓶水平上进行了发酵优化。首先,以胞外酶活力为指标,先后考察了初始培养基、p H、培养温度和培养时间4种因素对胞外表达的影响;然后,通过两阶段温度策略和助剂的添加进一步提高胞外表达水平。结果表明,当发酵培养基为TB、p H为7.5时,25℃培养24 h后胞外酶活力达到19.9 U/m L;同时,菌体生长最适温度和酶分泌的最适温度是不一致的,通过两阶段温度控制策略(即0~12 h控制温度30℃,12 h后温度调至25℃),胞外酶活力与单一温度条件下的最高水平(25℃)相比提高了1.4倍,达到了47.1 U/m L;在此基础上,进一步添加0.05%的吐温-80,将胞外酶活进一步提高40%,达到65.8 U/m L。     

粗状假丝酵母产脂肪酶发酵条件的优化

利用粗状假丝酵母发酵生产脂肪酶,通过对粗状假丝酵母胞外脂肪酶发酵过程的培养基和发酵培养条件的优化,得出产脂肪酶的最佳条件:碳源为聚乙烯醇乳化的橄榄油和葡萄糖,氮源为蛋白胨和尿素,酵母浸出液4.5g/L,MgSO4.7H2O0.4g/L,K2HPO43.5g/L;反应温度30℃,培养基初始pH7.0,接种量为10%,摇床转速180r/min,培养24h。在此发酵条件下,发酵液的最高酶活达到12U/mL。