超分辨显微技术在活细胞中的应用与发展

细胞是生命体的基本单位和功能单位,对活细胞内部结构及其功能的研究是了解掌握生命本质的基础之一,因此活细胞的实时观测对生命科学的发展具有重要意义。传统的光学显微技术受衍射极限的限制,无法观测200 nm以下的生物结构细节。近20年来,随着超衍射极限光学理论、技术、器件和荧光探针等方面的快速发展,超分辨显微成像技术已成为应用于生命科学研究的重要手段。然而,大多数超分辨显微方法或测量耗时长,或易引起荧光蛋白漂白/细胞损伤,在活细胞研究中受到极大限制,已成为超分辨显微领域重点攻关的方向之一。为此,文中结合作者在快速超分辨显微技术研究的基础上,介绍了基于单分子成像的光激活定位显微技术和随机光学重构显微技术、基于荧光非线性可饱和光转换的受激发射显微技术以及基于结构光照明的超分辨显微技术,并探讨了在活细胞成像中的发展应用。最后,文中展望了超分辨显微成像技术在活细胞成像中的未来发展趋势。     

随机光学重构显微术及其应用研究进展

在光学显微成像领域,涌现出一批可以突破衍射极限的超分辨显微成像技术,极大地增强了人们研究亚细胞结构的能力。基于单分子定位技术的随机光学重构显微术（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,STORM）具有易懂的成像原理、简单的工作方式以及超高的分辨率等特点,受到越来越多的研究者青睐。首先,介绍了单分子定位技术的原理,讨论了STORM光路的搭建,阐述了二维和三维STORM超分辨显微成像原理。其次,探讨了多色STORM以及STORM与电镜关联成像现状。最后介绍了STORM技术现阶段的应用进展。     

超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用（特邀）

观察细胞器间动态相互作用,深入分析作用规律,对于揭示生理病理过程现象背后的机制具有十分重要的意义。传统光学显微镜受到由光波波长和孔径造成的衍射极限的限制,无法观测细胞器纳米级精细结构及细胞器间相互作用的动态变化规律。超分辨显微成像技术的出现为细胞器相互作用研究提供了重要手段,在深入揭示细胞器相互作用规律,阐明生理病理现象深层的机制研究中发挥了重要的作用。文中介绍了受激发射损耗（Stimulated emission depletion, STED）显微成像、结构光照明显微成像（Structured illumination microscopy, SIM）、单分子定位显微成像（Single molecule localization microscopy, SMLM）技术,并总结了这三类超分辨显微成像技术在细胞器相互作用中的应用与现状,为超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用提供思路拓展。最后,对超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的优势与不足进行分析总结,展望了超分辨显微成像技术在活细胞内细胞器相互作用成像中的需求发展趋势,为光学与医学及生物学的交叉融合发展提供一定的参考。     

偏振荧光显微成像技术及研究进展（特邀）

生命体是由大量有机排列的分子组成的,其结构不仅与分子的位置分布有关,还与分子的排列方式和空间取向有关。偏振荧光显微成像技术利用荧光的偏振特性,能够对生物结构的分子取向进行观测和成像,进而从分子层面揭示生命活动的功能和代谢信息,有力推动了生物医学相关领域的研究和发展。本文从偏振荧光成像原理出发,对目前存在的多种偏振荧光显微成像技术进行原理介绍和现状分析,列举了其在生物医学领域的相关应用,讨论了其发展趋势及前景,旨在为该领域的科研人员了解偏振荧光显微成像技术提供参考。     

亚20nm荧光超分辨显微技术研究进展（特邀）

荧光超分辨显微技术自20世纪90年代诞生以来,经历了多代创新与发展,其空间分辨率已经远超衍射极限,横向分辨率能够达20 nm以下,可以实现分子尺度的生物成像与动态追踪。新一代超高分辨率显微技术的产生得益于传统超分辨技术的深度发展和结合创新。详细介绍横向分辨率在亚20 nm尺度的新一代荧光超分辨显微技术,并阐述其与传统超分辨原理的联系与区别。此外,针对分辨率的限制因素,就光学系统、扫描策略和样品制备等方面进行探讨,并展望高分辨率荧光显微技术在生物医学领域中的应用前景和发展方向。     

三维超分辨显微成像技术的研究进展及展望

超分辨显微成像技术是细胞生物学中研究细胞器结构、相互作用和蛋白质功能的强大工具,其具有突破光学衍射极限的分辨能力,从纳米尺度上为细胞生物学提供了新的分析手段,对生命科学相关领域具有重大意义.然而,受衍射极限的影响,超分辨显微镜的轴向分辨率相比于横向分辨率要更难以提高,这导致实现细胞结构亚百纳米分辨率的三维成像更为困难.从受激辐射损耗显微术和单分子定位显微术这两种主流技术出发,对目前存在的多种三维成像技术进行了原理介绍和特点分析,最后对其未来发展方向进行了展望.     

基于多测量矢量压缩感知的超分辨荧光显微成像研究

在超分辨荧光显微成像技术中,单分子定位显微方法是被广泛应用的技术之一。根据荧光显微成像原理构造多测量矢量压缩感知模型（Multiple Measurement Vector-Compressed Sensing, MMV-CS）,并采用多重稀疏贝叶斯学习算法进行求解,来实现超分辨荧光图像重建。分析了有效像元大小、荧光分子生成的光子数和背景信号泊松化噪声对重建结果的影响,以及在图像进行分块处理时算法运行时间的分析。模拟和实验计算分析表明,当点扩展函数的标准差在160 nm时,有效像元大小在120、160、200 nm能取得较好的重构效果,而在60 nm时效果较差。探测器收集的光子数越多,重构效果越好,随着背景信号光子数增加时,离得越近的样品结构越不能分辨。在同样的分块处理情况下,MMV-CS比同伦算法(L1-Homotopy, L1-H）和凸优化算法(CVX)分别快一个数量级和三个数量级,因此,在研究三维超分辨荧光显微成像时,MMV-CS算法在运行时间上具有更大的优势。     

高通量单分子定位显微成像技术进展（特邀）

由于衍射极限的存在,传统的光学成像手段无法观测细胞器结构及细胞器之间的相互作用。单分子定位显微成像技术作为三种超分辨技术中分辨率最高的成像技术,为生命科学领域的研究提供了重要手段。大视场高通量单分子成像技术具有分辨率高、成像范围大和成像时间短等特点,在生物医学领域广泛用于观察和分析复杂的生物结构和功能。从基于硬件扫描的拼接成像技术、基于大面阵sCMOS的大视场高通量成像技术、大景深单分子定位成像技术、高通量数据分析技术4个方面回顾近年来大视场高通量单分子定位技术的研究进展。最后,对大视场高通量单分子定位成像技术的发展方向进行展望。     

单分子中心定位精度与信噪比关系及中心定位算法改进研究

本文从理论和实验两个角度研究单荧光分子中心定位精度与信噪比的关系,提供了一种相对简单的方法来确定基于单分子中心定位技术的超高分辨显微成像系统的分辨率。特别是,本文给出一种提高定位精度的像素重建算法,在信噪比等条件不变的情况下,该算法可有效改善单分子定位精度,从而提高超高分辨成像系统的分辨率。     

用荧光光子统计测量作单分子识别与分辨

通过荧光光子的统计测量识别和分辨单个分子,在物理、生物、化学和信息处理等领域都有着广泛的应用。从识别和分辨两个方面分析总结了两类判别单分子的方法：一类是判别单分子光子源,其判别方法有两种：一种是利用开始一停止的方法测量光激发单分子荧光光场的二阶关联函数办法来识别;另一种是基于光子记数统计测量的判别方法。另一类是对于多种分子混合时,分辨探测到的单分子是哪种荧光分子。介绍了基于光子特性相关单光子统计测量,利用概率计算分析的两种方法：最大概率法和查表法。     

采用单分子光源的光学显微镜

纳米科学的快速进步已促使对超高分辨光学显微镜技术兴趣的急增。在近场通过一亚波长孔径照明在锐金属探针端部的物体 ,能超越衍射极限。该技术被推荐的改进涉及用纳米尺度的有源光源取代物体孔径。用近场和远场方法作单个荧光分子的空间和光谱探测的进步提出用单分子作照明光源的可能性。用荧光激发光谱学与剪切力显微术相结合 ,这里介绍用单分子作为点状照明光源拍摄的光学像。单分子探针有潜力在光学显微术中获得分子水平的分辨 ,改进侧向和轴向空间分辨 ,也将促进纳米现象 (如共振能量转移 )的可控研究。过去 2 0年来 ,采用孔径探针的扫…     

基于噪声校正主成分分析的压缩感知STORM超分辨图像重构

随机光学重构显微(STORM)的时间和空间分辨率相互制约,难以实现活细胞的超分辨成像,且超分辨图像的后处理分析与重构算法对图像质量也有非常重要的影响。基于此,针对高密度标记与高采样率所导致的单帧图像中光斑重叠及过多的背景噪声,提出一种用于单分子定位显微成像的新型噪声校正主成分分析(NC-PCA)方法,对单分子定位显微成像采集的图像进行预处理后再进行定位重构,提高了现有定位方法的定位精度,同时还实现了重叠分子的区分定位,从而提高了生物样品的标记密度,改善了超分辨成像的时间分辨率,可为活细胞单分子定位成像提供技术支持。     

大视场微球透镜超分辨显微成像技术的研究进展

光学显微镜是人类探索微观世界的重要工具,在生物学、医学、材料学、精密测量学等领域发挥重要作用。由于衍射极限的存在,发展更高质量、更高空间分辨率的超分辨光学显微成像技术成为当下研究的前沿热点。基于微球透镜的超分辨显微成像技术有着易于实现、简单直接和免标记的显著优点,发展潜力巨大。但是单个微球的视野有限,且难以进行精确定位。提高微球的可操控性,拓展超分辨显微成像视场的范围,已成为该技术突破发展的核心关键。文中在介绍微球超分辨的成像原理,分析影响成像质量主要因素的基础上,重点总结了国内外团队在拓展微球透镜超分辨显微成像视场方面的最新研究进展。根据微球的操控方式,将研究工作总结为机械接触控制、微球辅助增强层、非接触控制和微球物镜一体化四类进行介绍,探讨其技术特点,并对大视场成像、图像拼接等面向视场拓展的图像处理技术进行论述。最后,提出微球透镜超分辨显微成像技术亟待解决的关键问题、存在的难点与挑战,以及未来开展研究工作的突破点,展望了该技术的发展与应用拓展方向。     

单分子三维取向的探测方法

三维取向是单分子的一个重要特性,单分子三维取向研究是近年来对单分子研究的又一热点。综述了基于远场扫描的三种探测方法,阐述了其基本原理,分析、比较了各种方法的优缺点,讨论了进行单分子三维取向检测所存在的困难和实际问题,展望了其广阔的应用领域及前景。     

快速三维荧光显微成像技术的研究进展（特邀）

荧光显微成像具有高分辨率、高灵敏度、高分子特异性以及非介入性的优点,可以在微米乃至纳米尺度下表征样本的形态学与分子功能学信息,成为了生命科学研究的重要工具。随着微观生物学研究的不断深入,荧光显微成像被期待能够动态且立体地观测微观生物结构与分子事件。文中系统性地梳理了近年来快速三维荧光显微成像技术的研究进展,包括点扫描式成像、宽场成像与投影断层成像在提高成像速度、拓展成像维度以及增强成像质量等方面的主要技术手段、改进策略与代表性研究成果,并展望了快速三维荧光显微成像技术的未来挑战与发展前景。     

基于Pancharatnam-Berry相位透镜的三维单粒子定位方法研究

在三维单粒子追踪中,现有的双焦面轴向定位方法光路复杂,光利用率低,针对这一问题,提出了一种基于Pancharatnam-Berry相位透镜的三维单粒子定位方法.通过在传统荧光显微成像系统的光路中加入具有正负双焦距特性的Pancharatnam-Berry相位透镜,可以实现两个焦面同时成像在一个探测器上,利用在焦平面的光...     

三维拉曼显微成像技术研究进展（特邀）

拉曼显微成像技术无需样本制备,具有无损、无创、对水溶液不敏感的优点,可在微米或纳米尺度下表征样本的生化组分及分布,成为生命科学领域重要的研究工具。随着对复杂生物样本研究的不断深入,拉曼显微成像也被期待能够实现对生物样本中的分子组成与分布的动态立体观测。首先,系统性地梳理近年来三维拉曼显微成像技术的研究进展,包括基于自发拉曼散射、相干拉曼散射、表面增强拉曼散射以及拉曼标签的不同三维成像方法的技术手段、改进策略与实验结果。然后,总结了不同成像技术在细胞生物学、发育生物学等方面的应用进展。最后展望了不同三维拉曼显微成像技术在生物医学光学显微成像技术应用中所面临的挑战和发展前景。     

稀疏结构光照明三维层析显微技术

光学显微具有对样品损伤低、可特异性成像等优点，是生物医学、生命科学、材料化学等多个领域中必不可少的成像手段。然而，传统光学显微镜多采用平行光照明整个样品，无法有效区分在焦信号和离焦背景，不具备三维层析成像能力。基于此，提出一种基于共振扫描的稀疏结构光照明三维层析显微（SSI-3DSM）技术，通过共振扫描聚焦光斑快速生成稀疏条纹结构光，利用多步相移减除背景噪声实现对待测样品的三维层析成像。相较于扫描宽场成像，该方法将轴向分辨率提升1.3倍，信背比提升12倍。此外，该技术性能稳定、成本较低、便于商业化开发，可与结构光照明、单分子定位等超分辨显微成像技术相结合以进一步提高横向分辨率。     

超分辨成像中荧光分子定位算法性能比较

超分辨成像已成为活细胞结构和功能成像的关键工具,荧光分子定位是超分辨成像过程中不可缺少的步骤。从超分辨成像角度研究各种荧光分子定位算法性能具有重要的意义。选择5种典型的荧光分子定位算法:质心法、广义质心法、高斯拟合、解线性方程组和极大似然法,以定位精度和定位时间来评价所选择算法的性能。结果表明,1)高斯拟合、极大似然法和广义质心法能高精度对荧光分子定位,不受荧光分子所在子区域提取的影响;2)质心法和解线性方程组法能应用于图像在线分析,但定位精度较低,受子区域提取影响较大;3)当两个荧光分子位于一个衍射斑时,采用这5种算法的定位精度都会急剧下降。     

“2013中国光学重要成果”入选成果介绍

正(排序不分先后)基于等离激元增强拉曼散射的单分子化学成像中国科学技术大学侯建国院士研究团队(doi:10.1038/nature12151)在高分辨化学识别与成像领域取得重大突破,在国际上首次实现了亚纳米分辨的单个卟啉分子的拉曼成像。他们将具有低温超高真空环境的高分辨扫描隧道显微技术与具有单光子检测灵敏度的拉曼光谱技术结合在一起,利用隧道结中纳腔等离激