发酵温度对重组工程菌生长密度和干扰素表达的影响

目的 观察发酵温度对重组人干扰素α2a。（IFNα2a）工程菌PBV888/DH5α。生长密度和表达的影响。方法 采用NBS－40L发酵罐，在发酵过程中调整培养温度，检测工程菌的生长密度和IFN表达量。结果 经35℃培养至对数期，降温至30℃继续培养2－3h后升温至42℃进行诱导培养，连续实验3批次，平均生长密度A值为35．0，菌体湿重47g/L，IFN表达量为28×106IU/ml。结论 确立了工程菌生长和IFN表达的最适培养温度。     

诱导条件对重组大肠杆菌发酵中人白细胞介素6表达量的影响

对重组人白细胞介素6 (rhIL-6)大肠杆菌摇瓶发酵工艺作了研究.探讨了诱导策略对菌体生长和rhIL-6表达量的影响.结果表明,含有温敏扩增型质粒pKpL3a的重组hIL-6大肠杆菌,在2×YT培养基中发酵,接种量为0.2%,于30℃,180 r/min摇瓶中培养,当菌密度OD 600约为1.5时,转至42℃或40℃诱导,维持时间至少为1 h,然后转至37℃培养3 h,最终rhIL-6表达量可达32%.于40℃或42℃下诱导时间低于1 h,则使最终rhIL-6表达量降低 .如果采用42℃或40℃恒温诱导,rhIL-6表达量仅为20%.     

大孔离子交换树脂在重组大肠杆菌生产hEGF中的原位分离作用

引　言乙酸是重组大肠杆菌培养过程中的主要代谢副产物[1,2 ] ,乙酸的产生和积累对重组菌的生长和外源蛋白表达都有严重的抑制作用[3,4 ] .许多研究者对此开展了多方面的研究 ,如通过代谢工程手段构建乙酸酶缺陷菌株作为宿主菌来减少乙酸的产生[5] 、采用发酵 /分离耦合技术除去或降低乙酸量[6～ 8] 、透析培养技术[9,10 ] 、控制菌体的比生长速率及限制基质葡萄糖浓度等方法 .　　　本实验室开展了重组大肠杆菌分泌性高效表达人表皮生长因子 (humanepidermalgrowthfactor ,hEGF)的研究 ,发现在重组菌培养过程中乙酸的积累对重组菌生长和hEGF表达有严重抑制作用 .本文开展了高效吸附乙酸的离子交换树脂筛选 ,并在摇瓶和发酵罐规模两个水平上研究离子交换树脂在重组大肠杆菌发酵生产hEGF过程中对乙酸的原位分离作用 .1　材料与方法1 1　菌株与质粒E coliJM10 1/pSP10 3,本研究所保存的高效分泌型hEGF的重组大肠杆菌 .1 2　培养基及培养方法种子培养基和发酵培养基 ,种子培养、摇瓶培养及 2 5LB Braun发酵罐培养的条件参照文献[11],其中发酵培养基中...     

猪白细胞介素-2基因的原核表达、纯化及其生物学活性

目的原核表达、纯化猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2),并检测其生物学活性。方法以提取的猪外周血淋巴细胞基因组RNA为模板,PCR扩增猪IL-2基因,插入原核表达载体pBV220,构建重组表达质粒pBV220/IL-2。将重组表达质粒转化感受态大肠埃希菌DH5α,经含Amp的LB平板筛选后,将重组菌于LB培养液中培养,分别于不同培养时间进行活菌计数,绘制重组菌的生长曲线;42℃诱导表达重组蛋白,经尿素纯化后,采用CTLL细胞/MTT比色法检测其生物学活性。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;重组菌的最佳开始诱导时间为重组菌发酵培养10 h;重组蛋白相对分子质量约17 400,表达量占菌体总蛋白的19%,纯化后纯度达95%;重组蛋白的生物学活性可达3×105IU/ml。结论原核表达并纯化了具有生物学活性的重组猪IL-2蛋白,为其进一步研究和产业化生产奠定了基础。     

一种铜锌超氧化物歧化酶突变体的原核表达、纯化及酶活性测定

目的原核表达、纯化一种铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)突变体,并检测其酶活性。方法将经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体基因亚克隆至pET-28a载体中,构建重组表达质粒SOD1-pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达;在500 mL摇瓶培养条件下,通过改变加入Cu、Zn离子的量优化诱导表达条件;表达的重组蛋白经初步纯化后,测定酶活性。结果重组表达质粒SOD-pET-28a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为15 000,主要以可溶性形式表达;工程菌株在500 mL摇瓶培养条件下培养至10 h左右,A_(600)至3. 5左右时加入终浓度为0. 1 mmol/L IPTG、0. 2 mmol/L ZnCl_2、0. 5 mmol/L CuSO4,可获得最佳表达量(29. 2%);初步纯化获得的重组蛋白纯度为97. 32%,比活为5. 08×103U/mg。结论成功利用大肠埃希菌表达系统表达了一种经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体,初步纯化的突变体具有较好的酶活性,为进一步摸索大规模生产工艺及实际应用奠定了基础。     

Mg~(2+)和氨基酸对重组大肠杆菌BL21(DE3)生长及羧肽酶原B表达的影响

目的研究Mg2+和氨基酸对重组菌株生长及表达pCPB的影响。方法通过摇瓶和发酵罐培养,观察不同Mg2+浓度和氨基酸对重组菌的生长和羧肽酶原B表达的影响。结果添加1g/L Mg2+能提高质粒的稳定性;添加氨基酸能使羧肽酶原B表达量由18·7g/L提高到24g/L。结论添加适量的Mg2+和氨基酸能促进重组菌的生长和提高目的蛋白的表达量。     

原核表达融合型血管生成抑制剂Kringle 5发酵条件的优化和初步纯化

在构建融合型Kringle 5原核表达重组菌BL21(DE3)pET32a/K5的基础上,通过改变培养基的成分,确定了适宜于重组菌生长和融合Kringle 5蛋白表达的培养基.采用正变实验方法,对融合型血管生成抑制剂Kringle 5原核表达重组菌的发酵条件进行了优化,通过发酵罐中重组菌的分批培养,确定了培养液中的最佳溶氧量.采用优化后的发酵工艺,在20 L发酵罐中融合Kringle 5的表达量可达0.59 g·L-1.最后在Cu2 螯合的Sepharose Fast Flow层析介质上对融合Kringle 5进行了初步纯化,其纯度约为80%.     

argE基因的表达优化及Zn2+添加时间和浓度的影响机制分析

确定了目的基因argE在重组菌BL21(DE3)-pET22b-argE中的表达位置,研究了Zn2+对重组菌生长及表达产物活性的影响,并分析了影响机制. 结果表明,argE可在重组菌中高效表达,表达产物N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶大多以不可溶的包涵体形式存在,只有少量为有活性的可溶性表达. 1.0 g/L的Mg2+对重组菌的生长及酶活有明显促进作用. Zn2+加入时机及加入量不同,影响结果也不同. 发酵起始加入Zn2+严重抑制菌的生长及酶活,而在1.0%乳糖诱导2.5 h后加入则可解除生长抑制并提高酶活. SDS-PAGE电泳及活力测定证实Zn2+参与形成酶的催化中心,对酶的表达量没有影响.     

重组人白细胞介素-4融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达的影响因素

目的　提高人重组白细胞介素 4 (rhIL 4 )在大肠杆菌中的表达量。方法　研究rhIL 4的体外诱导条件 ,包括诱导时间、IPTG浓度、诱导温度、菌体密度对表达量的影响。结果　最佳表达条件是诱导时间为 4h ,诱导温度为 4 2℃ ,A6 0 0 为 0 7～ 1 0 ,而IPTG的浓度对表达量无显著影响。结论　诱导时间、诱导温度和菌体密度的优化能提高外源基因在大肠杆菌中的表达产量。     

表达人肝细胞生长因子突变体——NK4工程菌的发酵工艺研究

目的　建立重组NK4融合基因工程菌的发酵工艺。方法　采用锥形瓶、发酵罐发酵 ,对工程菌生长和表达条件如pH、诱导时间及诱导剂浓度等方面进行优化。确定其最佳诱导表达条件 ,在 15L自控发酵罐中进行分批补料培养。结果　在 15L发酵罐进行工程菌发酵 ,菌体收获量湿重可达 2 4 .6g L± 0 .98g L ,目的蛋白的表达量保持在菌体总蛋白的 5 0 %左右 ,发酵时间为 11h。结论　建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺。     

表达人粒细胞集落刺激因子大肠杆菌的优化

通过对hG CSF重组基因表达效率和工程菌遗传稳定性的比较 ,建立的一种全新的双质粒双重诱导的原核高效表达体系。构建了pGP1 2 pJGW1 hGCSF DH5α工程菌 ,经 42℃热诱导 ,hG CSF的表达率达 2 7%以上 ,经典质粒遗传稳定性实验 (140代 )证实 ,具有良好的遗传稳定性。     

导向性人干扰素α2a工程菌生物学特性的稳定性

目的 全面观察了解pBV220-IFNN/DH5α工程菌生物学特性的稳定性。方法 工程菌菌株连续传至50代后,进行质粒性状、扫描电镜观察、干扰素表达水平、革兰氏染色及各项生化反应检测。结果 pBV220-IF-NN/DH5α工程菌呈现典型的大肠杆菌形态,各代次菌的各项检测结果与原始菌种差异无显著意义。结论 该菌种可作为生产用菌种。     

日本血吸虫核酸疫苗质粒适宜宿主菌的筛选及其发酵条件的优化

目的筛选二价日本血吸虫核酸疫苗质粒的适宜宿主菌,并对其发酵条件进行优化。方法通过综合考察细胞干重、质粒DNA产量及工程菌传代的质粒稳定性等参数,确定适宜宿主菌及其相适应的发酵培养基碳源、氮源和磷酸盐类型;进一步通过中心组合设计响应面试验,优化发酵培养基,并对优化的发酵培养基进行实验验证。结果确定适宜宿主菌为E.coliDH5α,优化的发酵培养基(m/v)为:NaCl1.0%,Yeast Extract1.0%,磷酸盐0.3%[其中m(K2HPO4)∶m(KH2PO4)=1∶4],甘油1.68%,牛肉汁2.28%,豆饼汁4.21%。在此发酵条件下,菌体干重由原来的1.57mg/ml增长至5.68mg/ml,质粒DNA产量由原来的3.94μg/ml增长至36.52μg/ml。结论已筛选出日本血吸虫核酸疫苗质粒适宜宿主菌,并优化了其发酵条件,明显提高了质粒DNA产量,具有大规模发酵生产应用价值。     

人血小板衍生生长因子-BB在酿酒酵母中的表达及纯化工艺的建立

目的建立重组人血小板衍生生长因子-BB(hPDGF-BB)在酿酒酵母中的表达及纯化工艺。方法在5L发酵罐中,探讨接种量、溶氧、诱导温度和诱导pH值对菌体密度及目的蛋白表达量的影响,并通过离子交换层析和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化。结果重组hPDGF-BB工程菌在5L发酵罐分批补料培养中,经84h发酵,细胞A600值可达65.1,目的蛋白表达量占26%。纯化后的蛋白纯度可达95%,产量为15.4mg/L,收率为21.9%。结论已建立了周期短、产率高的hPDGF-BB发酵及纯化工艺,为其大规模生产奠定了基础。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数,检测工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性,通过摇瓶培养确定培养基组成,再在30L发酵罐内,通过改变培养基成分、培养时间、补料方式,确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵,同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2.S和DH5α/pFP在连续传代30次后,质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养,梯度恒速流加方式补料,培养时间为10h。通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌58.0~71.8g/L,质粒含量可达到1.11~1.58mg/g菌,超螺旋质粒DNA的比例达93%以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。     

RGD特异性结合多肽与重组改构人肿瘤坏死因子融合基因的克隆表达及其抑瘤活性

目的构建RGD多肽与重组改构人肿瘤坏死因子融合基因,进一步提高rmhTNF的临床疗效。方法应用基因重组技术构建了CRGDC与rmhTNF的融合基因,在E.coliDH5α中诱导表达重组蛋白RGDrmhTNF,采用溶菌酶法裂解菌体,裂解上清经硫酸铵沉淀、阴阳离子交换层析纯化后,用S180荷瘤小鼠模型和L929细胞体外杀伤实验测定纯化的重组蛋白RGDrmhTNF的体内、外杀伤活性。结果正确构建了编码RGDrmhTNF融合基因,重组工程菌升温诱导后以部分可溶形式表达RGDrmhTNF,纯化后纯度为96.88%,体外对L929细胞杀伤作用的比活性为3.6×108IUmg,与rmhTNF相当(3.0×108IUmg)。在S180荷瘤小鼠模型中,当RGDrmhTNF剂量为12×105IUkg时,对肿瘤的生长抑制率为84.9%,显著高于相同剂量的rmhTNF(肿瘤抑制率为59.09%,P<0.01)和环磷酰胺组(肿瘤抑制率为71.21%,P<0.01)。结论重组蛋白RGDrmhTNF可以提高rmhTNF的治疗效果。     

重组人B7-H1IgV发酵纯化工艺的建立及其抑瘤活性

目的建立大规模生产重组人B7-H1IgV(rhB7-H1IgV)的发酵和纯化工艺,并检测纯化蛋白的抑瘤活性。方法对rhB7-H1IgV工程菌进行发酵培养,IPTG诱导表达,采用超声裂菌分离包涵体,梯度复性,2次Ni亲和层析等步骤纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE、Westernblot分析及抑瘤活性检测。结果在建立的发酵工艺下,rhB7-H1IgV的表达量可达菌体总蛋白的(10～11)%;纯化的rhB7-H1IgV蛋白经HPLC检测,纯度可达95%以上,Westernblot检测具有良好的反应原性;动物实验表明纯化的重组蛋白能诱导BALB/c小鼠产生高滴度的抗B7-H1抗体,且对肿瘤的生长具有明显的抑制作用。结论所建立的rhB7-H1IgV发酵纯化工艺简单迅速,为其开发和应用奠定了基础。     

重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌生物学特性的稳定性

目的观察重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌pKKH-BLyS/DH5α生物学特性的稳定性。方法工程菌连续传50代,每10代进行目的蛋白表达水平、质粒性状检测、透射电镜观察、革兰染色及各项生化检查,观察工程菌生物学特性的稳定性。结果0、10、20、30、40和50代工程菌之间目的蛋白的表达量无明显差异,基本维持在40%左右;双酶切、PCR及测序结果均与原代质粒相符;革兰染色均呈阴性;透射电镜观察及各项生化反应均呈现典型的大肠杆菌特性。结论该菌种生物学特性稳定,可作为生产用菌种。     

密码替换后人促红素基因在大肠杆菌中的高效表达及工程菌的发酵

目的　研究人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中高效表达及工程菌高密度发酵条件。方法　将hEPO基因中大部分大肠杆菌稀有密码子替换成使用频率较高的密码子 ,人工合成hEPO全基因 ,然后将其插入表达载体PBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌DH5α ,挑选构建正确的PBV2 2 0 hEPO DH5α菌落 ,经升温诱导 ,SDS- PAGE和Westernblot鉴定表达产物 ;观察改变培养基、培养时间、pH及溶氧量等条件对表达产物的影响。结果　经酶切分析 ,DNA测序鉴定 ,人工合成的hEPO基因已正确构建到表达载体中。通过高密度发酵培养 ,最终菌体密度达A6 0 0 =30 (相当于菌体 35g L) ,hEPO表达量达 30 %左右。结论　人工合成的hEPO基因在大肠杆菌中得到高效表达 ,并确定了该工程菌高密度发酵的适宜条件。     

百日咳毒素S1亚单位的表达及其免疫原性研究

目的 研究百日咳毒素S1(Pertussis toxin s1 subunit)亚单位在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性。方法 采用PCR法从百日咳杆菌染色体中获得S1亚单位的结构基因并克隆到质粒pCR2.1-TOPO中,转化宿主菌DH5α和TOPO10。用抗S1的单抗1B7检测表达产物。用粗制的重组S1(rS1)免疫小鼠,做主动免疫保护实验。rS1免疫家兔,检测rS1的免疫原性。并以家兔免疫血清在小鼠进行被动免疫保护实验。结果 rS1可在大肠杆菌中稳定高效表达,表达量分别占细胞总蛋白量的14％(DH5α)和24.2％(TOPO10)。rS1能被1B7识别,在小鼠主动免疫实验中,保护率可达56.3％。家兔免疫血清ELISA效价为1:32 000。抗rS1血清对小鼠被动的免疫保护率为100％。结论 rS1具有良好免疫原性,为百日咳基因工程疫苗或亚单位疫苗研制及百日咳免疫机理研究提供了依据。