产肠毒素大肠埃希菌K99-987P-F41融合蛋白在小鼠体内免疫效果的评价

目的评价产肠毒素大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99-987P-F41融合蛋白在小鼠体内的免疫效果。方法制备ETEC融合蛋白K99-987P-F41亚单位疫苗、ETEC全菌体灭活疫苗、ETEC天然菌毛K99-987P-F41混合蛋白亚单位疫苗及ETEC重组菌毛K99-987P-F41混合蛋白亚单位疫苗,分别免疫小鼠,同时以免疫PBS的小鼠作为对照。ELISA法检测小鼠血清中IgG、IL-4和IFNγ的水平及小鼠粪便和小肠冲洗液中分泌型免疫球蛋白A(secreted immunogobulin A,sIgA)的含量;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况,并进行攻毒试验。结果 ETEC融合蛋白K99-987P-F41重组亚单位疫苗组小鼠血清中的抗ETEC的特异性IgG抗体、IL-4、IFNγ、粪便和小肠冲洗液中的sIgA、小鼠脾脏B和T淋巴细胞增殖能力均显著高于PBS对照组(P0.05);ETEC融合蛋白K99-987PF41重组亚单位疫苗对小鼠的保护率为80%,与其他3种疫苗的小鼠保护率相近,而PBS对照组为0。结论 ETEC融合蛋白K99-987P-F41可有效诱导小鼠产生较高滴度的特异性抗体,可作为ETEC重组亚单位疫苗候选蛋白。     

生长抑素(SS)基因在大肠杆菌pT7ZZ表达系统中的克隆与表达

目的 构建和筛选既能稳定、高效表达SS融合蛋白，又能使这种融合蛋白保持良好的SS抗原性和高水溶性等特点的重组质粒。方法 用 BamH I/Xho I (B/X）和 BamH I/EcoR I（B/E）双酶切，将含有SS基因的片段由pThioHis A中切出，然后分别克隆到 pT7ZZa中的相应酶切位点，得到pSSB/X（短尾）和pSS-B/E(长尾)两个重组质粒，用常规表达技术在大肠杆菌中对其进行表达。结果 pSS-B/X和pSS-B/E两个重组质粒在宿主菌BL21（DE3）中均获得表达，pSS-B/X获得高效表达后融合蛋白占菌体总蛋白的30．6％。两个表达菌经超声裂解后电泳发现，SS－B/X－ZZ和SS－B/E－ZZ这两种融合蛋白基本为可溶性蛋白，沉淀中含量极低。二者均具有良好的抗原性，结论pSS-B/X重组质粒很有希望成为SS基因疫苗的候选质粒。     

EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

目的在原核表达系统中表达肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHECO157∶H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测。方法PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+)-espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果。通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用。结果重叠延伸PCR方法扩增出1319bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%。两种温度下,目的蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%。Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应。融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157∶H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应。融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%。免疫小鼠血清可以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用。结论已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHECO157∶H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础。     

B族链球菌表面免疫原性蛋白的免疫原性及其抗体保护功能

目的制备B族链球菌(GBS)表面免疫原性蛋白(Sip),研究其免疫原性及抗体保护功能,为GBS蛋白疫苗研究奠定基础。方法采用基因重组技术构建表达载体,并表达GP-Sip融合蛋白。用pET-Sip融合蛋白免疫小鼠,并免疫家兔制备多克隆抗体。Western blot检测GP-Sip蛋白特异性,ELISA检测家兔及小鼠血清中特异性抗体水平,调理吞噬试验检测Sip抗血清的功能。结果表达载体经酶切和测序证明构建正确,GP-Sip蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,纯化后纯度可达90%以上。Western blot显示GP-Sip蛋白可与pET-Sip蛋白的免疫血清发生免疫反应。ELISA显示Sip可诱发小鼠产生高水平的IgG抗体。Sip抗血清具有明显地促进吞噬细胞对GBS的吞噬作用。结论已成功构建GP-Sip表达载体,并高效表达了Sip。该蛋白具有良好的免疫原性,其抗体具有良好保护功能,可作为GBS蛋白疫苗成分或荚膜多糖疫苗载体成分。     

幽门螺杆菌多亚单位融合蛋白疫苗的构建及免疫特性

目的构建幽门螺杆菌HspA、HpaA、UreB多亚单位融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性及免疫保护性。方法用PCR从Hp基因组中分别扩增HspA、HpaA、UreB3个基因片段,重叠延伸PCR将其构建成融合基因hhu,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切、测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,AKATA纯化仪纯化。纯化后蛋白口服免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体,末次免疫后进行攻毒试验,检测其免疫保护性。结果酶切及测序证实已成功构建HspA、HpaA、UreB融合基因的表达载体phhu,SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的表达,表达率为26·8%,纯化的融合蛋白纯度大于90%,口服免疫小鼠可产生特异性抗体,保护率达89·6%。结论所获得的融合蛋白保持了亚组分蛋白各自的免疫原性和免疫保护性,为幽门螺杆菌多亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

生产场地变更后甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)的抗原特性

目的研究生产场地变更后,原生产工艺制备的甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)的抗原特性。方法采用双抗体夹心ELISA法检测在新场地制备的甲肝灭活疫苗病毒浓缩液和疫苗原液的甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗原含量。SDS-PAGE和Western blot分析二者的蛋白组分和特异性;疫苗成品(成人剂量)稀释为不同剂量(640、320、160、80和40 EU),免疫ICR小鼠(并设铝佐剂对照组),采用竞争ELISA法检测小鼠血清中HAV抗体效价;同时称量免疫后不同时间小鼠体重。结果病毒浓缩液和疫苗原液的HAV抗原含量分别为12 800和3 200 EU/ml。疫苗原液中仅含HAV结构蛋白组分,且可与HAV抗体特异性结合。初免后28 d,640、320和160 EU剂量疫苗组小鼠血清抗体阳转率为100%,80和40 EU剂量疫苗组二免后血清抗体阳转率达100%和90%,所有免疫组小鼠血清抗体效价二免后14 d较初免28 d上升约2倍;疫苗免疫组小鼠体重及体重增幅与佐剂对照组相比,均无药物作用引起的异常变化(P0.05)。结论在新场地采用原生产工艺制备的甲型肝炎灭活疫苗原液有单纯的抗原蛋白组分和免疫学特异性,且与前期研究结果相比,其免疫原性及安全性具有一致性。     

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体诱导的免疫应答

目的观察鼻咽癌人源抗独特型单链抗体G22ScFv在小鼠体内诱导的免疫应答,探讨其作为鼻咽癌疫苗的可能性。方法在大肠杆菌中诱导表达G22ScFv并进行纯化,以纯化的G22ScFv免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA及竞争抑制ELISA检测免疫小鼠特异性体液免疫应答水平;流式细胞术检测免疫小鼠脾T淋巴细胞表型的变化。结果纯化的融合蛋白纯度达95%以上,且具有良好的反应原性。经ELISA检测,G22ScFv免疫后,小鼠产生了Ab3,且小鼠脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞数量升高。结论G22ScFv可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答,为鼻咽癌人源抗独特型抗体疫苗的临床应用奠定了基础。     

产肠毒素大肠杆菌987P菌毛蛋白FasA亚单位的原核表达及其免疫原性

目的表达、纯化产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)987P菌毛蛋白FasA亚单位,并检测其免疫原性。方法将去掉5′端信号肽序列的fasA基因克隆至原核表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-fasA,转化E.coli M15,0.5 mmol/L IPTG诱导表达。表达的融合蛋白6×His-FasA经Ni-Agarose His纯化和复性后,经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,每次100μg,共免疫3次,间隔2周,末次免疫10 d后,摘除小鼠眼球取血,分离血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果重组表达质粒pQE-30-fasA经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的6×His-FasA融合蛋白相对分子质量约为18 500,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%;纯化的蛋白纯度可达95%,浓度为0.6 mg/ml,免疫小鼠所得抗血清效价为1∶125 000。结论已成功在E.coli M15中表达了6×His-FasA融合蛋白,纯化的融合蛋白免疫原性良好,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。     

重组金黄葡萄球菌肠毒素B及热休克蛋白65融合蛋白的原核表达及其在小鼠体内的体液免疫效果

目的原核表达重组金黄葡萄球菌肠毒素B(recombinant Staphylococcus aureus enterotoxin B,r SEB)及热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65)融合蛋白r SEB-HSP65,并探讨其在小鼠体内的体液免疫效果。方法采用分子生物学方法将修改过TCR Vβ结合区的r SEB基因与HSP65基因融合,构建重组表达质粒p ET-28a-r SEB-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经铜柱亲和层析纯化。将纯化蛋白经小鼠背部皮下注射,分别于第0、14、28天各免疫1次,分别于第14、28、42 d经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-SEB的Ig G水平。结果重组表达质粒p ET-28a-r SEB-HSP65经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白r SEB-HSP65的相对分子质量约85 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占全菌总蛋白的40.81%,纯化蛋白纯度约为90%。各组免疫小鼠均可产生较高滴度抗体,且在第14、28及42天大部分含铝佐剂疫苗组的效价显著高于相同剂量的无铝佐剂疫苗组(P<0.05),第42天时无铝佐剂低剂量疫苗组与含铝佐剂低剂疫苗量组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功在E.coli BL21(DE3)中表达了重组蛋白r SEB-HSP65,且可诱导小鼠产生较高的抗体水平。     

百日咳毒素S1亚单位的表达及其免疫原性研究

目的 研究百日咳毒素S1(Pertussis toxin s1 subunit)亚单位在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性。方法 采用PCR法从百日咳杆菌染色体中获得S1亚单位的结构基因并克隆到质粒pCR2.1-TOPO中,转化宿主菌DH5α和TOPO10。用抗S1的单抗1B7检测表达产物。用粗制的重组S1(rS1)免疫小鼠,做主动免疫保护实验。rS1免疫家兔,检测rS1的免疫原性。并以家兔免疫血清在小鼠进行被动免疫保护实验。结果 rS1可在大肠杆菌中稳定高效表达,表达量分别占细胞总蛋白量的14％(DH5α)和24.2％(TOPO10)。rS1能被1B7识别,在小鼠主动免疫实验中,保护率可达56.3％。家兔免疫血清ELISA效价为1:32 000。抗rS1血清对小鼠被动的免疫保护率为100％。结论 rS1具有良好免疫原性,为百日咳基因工程疫苗或亚单位疫苗研制及百日咳免疫机理研究提供了依据。     

猪圆环病毒病和繁殖与呼吸综合征二联灭活疫苗的安全性及免疫保护力

目的观察猪圆环病毒病(PCVD)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)二联灭活疫苗的安全性及免疫保护力。方法分别用超剂量疫苗免疫妊娠母猪和3～4周龄断奶仔猪,以观察疫苗的安全性及对妊娠母猪产仔的影响;并用3批疫苗分别免疫3～4周龄断奶仔猪,检测血清中ELISA和中和抗体效价;免疫后28d,分别用PRRSV CC株和PCV2 NM株攻毒,观察临床反应,并进行病理组织学检查,计算疫苗保护率。结果超剂量疫苗免疫对妊娠母猪和断奶仔猪均安全,无任何不良临床反应。免疫断奶仔猪后7d可检测到血清抗体,PCV2及PRRSV攻毒后的保护率均不低于80%。结论 PCVD和PRRS二联灭活疫苗安全、有效,可用于PCVD和PRRS的预防。     

Dietary α-linolenic acid increases the n−3 PUFA content of sow's milk and the tissues of the suckling piglet

alpha-Linolenic acid (18:3n-3) is a precursor to DHA (22:6n-3), which is essential for normal growth and development in the infant. This study was undertaken to assess how a raised 18:3n-3 intake in sows affects the n-3 PUFA content of the suckling piglet. Sows consumed a high-18:3n-3 or control diet (n-3 PUFA/n-6 PUFA, 0.5 vs. 0.05, respectively) for 10 d prior to parturition and for 14 d postpartum. Piglets suckled from their mothers until 14 d of age, when they were sacrificed. Sows consuming the high-18:3n-3 diet had 141% more 18:3n-3 and 86% more 22:6n-3 in their milk compared to control sows. There was no difference in the proximate composition of the piglets. The n-3/n-6 PUFA ratio was 82% higher in the milk of sows consuming the high-18:3n-3 diet compared to controls. Piglets suckling from sows consuming the high-18:3n-3 diet had 423% more 18:3n-3 in the carcass as well as a 460% higher n-3/n-6 PUFA ratio than controls. The piglets suckling from sows consuming the high-18:3n-3 diet had 333% more 18:3n-3 and 54% more 22:6n-3 in the liver, as well as a 114% higher n-3/n-6 ratio than control piglets. Piglets suckling from sows consuming a high-18:3n-3 diet also had 24% more 22:6n-3 and a 33% higher n-3/n-6 ratio in the brain compared to control piglets. A high 18:3n-3 intake in the sow increases not only the 18:3n-3 but also the 22:6n-3 content of sow's milk and the tissues of the suckling piglet.     

麻疹-乙脑二联活疫苗脑内注射小白鼠的安全性及神经组织病理变化

目的　了解麻疹－乙脑二联活疫苗注射小白鼠脑内的安全性及神经组织病理变化。方法　小白鼠 脑内注射二联活疫苗后，观察体征反应和组织病理变化。结果注射后５～９ｄ有个别小鼠发病，１１～１４ｄ恢复正 常。脑组织病理检查时有轻微病变，７ｄ较明显，２１ｄ基本消退；病变以神经细胞变性及炎性细胞浸润为主，病变 分值在Ｖ－１，个别达Ｖ－２级。上述结果与同批单价乙脑活苗相同，而同批单价麻疹活苗和冻干保护剂却无体征反 应，也无组织病理损伤。结论二联苗注射小白鼠脑内后的体征反应和脑组织病理变化系乙脑１４－２株病毒所致。     

泌尿道致病性大肠埃希菌PapG重组蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用

目的探讨泌尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)P菌毛粘附素PapG重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染的免疫保护作用。方法纯化蛋白按一定程序免疫BALB/c雌性小鼠,末次免疫后第7天用UPEC临床分离株进行尿道上行攻击;攻击后第5天检测尿液和肾脏培养菌,同时测定血清抗体效价。结果经GST-PapG重组蛋白和GST纯化蛋白免疫的小鼠体内均产生了相应的抗体,而仅经重组蛋白免疫的小鼠具有一定的抵抗毒株上行感染的能力,表现为肾脏培养菌量均明显减少。结论PapG粘附素与GST构成的重组融合蛋白对小鼠尿道上行感染具有一定的免疫保护作用。     

狂犬病毒糖蛋白DNA疫苗的构建及免疫效果的研究

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因DNA疫苗,并检测其免疫小鼠的免疫应答。方法用RT-PCR法扩增和分离CTN株狂犬病毒糖蛋白基因,测序后克隆入VR1055载体中,构建重组质粒VR1055-CTN,经碱裂解法提取质粒,并经Sepharose4FF柱层析纯化后免疫NIH小鼠,用ELISA法检测体液抗体,用MTT法检细胞免疫,并进行常规效力试验。结果VR1055-CTNDNA疫苗具有较好的诱导狂犬病毒抗体的能力,在诱导细胞免疫中,刺激脾淋巴细胞转化指数和小鼠血清中的IL-2活性均高于空白载体对照,差异有显著意义(P=0.000)。效力试验的小鼠存活率分别为73%和25%。结论该疫苗既能诱导体液免疫,又能诱导细胞免疫,并具有较好的免疫保护效果。     

重组酵母乙型肝炎疫苗(60μg)抗-HBs阳转率及接种反应

目的观察重组酵母乙型肝炎疫苗(60μg)抗-HBs阳转率及接种反应。方法对河北省承德市滦平县89名(男52名,女37名)因按常规免疫程序(0、1、6)接种重组酵母乙肝疫苗(10μg)未产生免疫应答者重新接种重组酵母乙型肝炎疫苗(60μg)2针次,间隔4周。分别于末次免疫后1和6个月采血,分离血清,采用乳胶化学检测法检测抗-HBs水平,并计算阳转率;分别于首次和末次免疫后30 min及72 h内,观察局部(疼痛、瘙痒、硬结)和全身(发热、乏力、腹泻)不良反应。结果末次免疫后1个月,男性抗-HBs阳转率为96%,女性为97%,末次免疫后6个月,男性抗-HBs阳转率为98%,女性为100%,男女抗-HBs阳转率差异均无统计学意义(P>0.05),免疫2针次后,抗-HBs阳转率接近100%。首次和末次免疫后30 min及72 h内,局部和全身不良反应发生率均未超过6%。结论重组酵母乙型肝炎疫苗(60μg)可提高按常规程序接种乙肝疫苗未产生免疫应答人群的抗-HBs阳转率,且疫苗接种后局部和全身不良反应发生率较低,可推广使用。     

缓释微球乙型肝炎疫苗的初步研究

目的　研制缓释微球乙型肝炎疫苗。方法　用聚－ＤＬ－乳酸－聚乙二醇共聚物（ＰＥＬＡ）为材料,包裹乙 型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）,制成缓释微球疫苗。微球的粒径均小于５ｕｍ,平均粒径为２．１７ｕｍ,抗原包裹量为１．２５％, 包裹率为６０－８０％。用 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测抗原,以微球疫苗免疫 ＢＡＬＢ／ｃ。小鼠。结果 ＨＢｓＡｇ的结构包裹前后是一致 的,小鼠经皮下注射单剂微球疫苗后,在第 １４ｗ,小鼠血清 ＩｇＧ滴度可达到铝佐剂疫苗相当的水平,且维持较高的滴 度。结论采用生物可降解的缓释微球作为乙肝疫苗载体系统具有潜在的优势。     

Male Urinary Chemosignals Differentially Affect Aggressive Behavior in Male Mice

Chemical signals modulate aggressive behavior in mice. For example, male urinary cues enhance aggression against other adults: a resident mouse attacks a male but not a castrated intruder, unless it is anointed with male urine. Our purpose was to understand whether molecules excreted with urine also act as aggression triggers in a different context. Therefore, the effect of urine, or molecules purified from urine, voided by different animals (males or females), was tested on the aggression of male mice against pups. Latency to the first attack, percentage of pups receiving the first attack, and percentage of attacked pups after 5 and 15 min were recorded. At variance with intermale aggression, male urinary chemosignals sprayed on pups reduced infanticide, while female urine did not. Male urine also delayed infanticide when compared to female urine. Pups anointed with low molecular weight dialyzed urine and with the high molecular weight protein fraction were attacked later than controls. Pups anointed with Major Urinary Proteins (MUPs) also were attacked later. The volatiles retained by MUPs act in the same way as adult male urine. MUPs and their ligands did not modify biting of food items. The results show that mice do not perceive male chemosignals as compulsory aggression triggers but rather can consistently and differentially shape their behavior in response to the same molecules according to different contextual events.