人脐带华通氏胶间充质干细胞的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力

目的探讨人脐带华通氏胶间充质干细胞(human umbilical cord Wharton′s Jelly mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的生物学特性及其向肌源性细胞分化的能力。方法收集健康足月产胎儿脐带组织,采用酶消化法从华通氏胶中分离hUCMSCs,选取第3代对数生长期细胞,显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞免疫表型分子的表达,免疫荧光染色检测干细胞标记物及其体外向肌源性细胞的分化,荧光显微镜观察及流式细胞术检测携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染hUCMSCs后GFP的表达。结果采用酶消化法获得可贴壁生长的大量hUCMSCs,其能在体外成功进行扩增培养。hUCMSCs可高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,而极低表达CD14、CD34、CD45和HLA-Ⅱ;能表达干细胞标记物Oct4和Sox2,且在体外特殊培养条件下表达骨骼肌干细胞标记物Pax7和Myo D;转染的hUCMSCs可稳定表达GFP,转染率高达50%~70%。结论人脐带华通氏胶组织存在间充质干细胞,且其具有向肌源性细胞分化的潜能。     

二次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞

目的采用二次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)。方法将传统组织块贴壁法弃掉的脐带组织块转移至新的培养瓶中进行二次贴壁,分离hUC-MSCs,并用无血清培养体系连续传代,镜下观察细胞形态;分别检测不同代次细胞的增殖能力、细胞周期、免疫表型、多向分化能力。结果二次贴壁法分离的hUC-MSCs在第4天即出现细胞克隆,第8天汇合度可达70%,经过二次贴壁法,1根20 cm的脐带组织共获得P3间充质干细胞(MSCs)总数为1×10~9个。二次贴壁分离的细胞增殖能力旺盛,与一次贴壁获得的干细胞同代次平均倍增时间差异无统计学意义(P0.05)。传统贴壁法与二次贴壁分离的细胞均表达超过98%的CD73、CD90、CD105和低于2%的CD34、CD45、CD14、CD79a、HLA-DR,且该细胞具有分化为成骨、成软骨和成脂能力。结论经无动物源培养体系体外扩增的二次贴壁分离方法可以获得大量具有MSCs生物学特性的hUC-MSCs,为其规模化临床应用奠定了基础。     

二次贴壁法获得的人脐带间充质干细胞的体外安全性及其对1型糖尿病大鼠血糖的调节作用

目的探讨二次贴壁法获得的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的体外安全性及其对1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)大鼠血糖的调节作用,为临床T1D的治疗提供实验依据。方法采用二次贴壁法从人脐带中进行多能干细胞的大规模培养,建立主细胞库(master cell bank,MCB)和工作细胞库(working cell bank,WCB),对干细胞的免疫表型、体外致瘤性、核型、端粒酶进行检测,以确定其体外安全性;通过干细胞体内移植试验初步分析其对T1D大鼠葡萄糖转化能力的影响。结果以1根20 cm脐带作为材料,经二次贴壁分离扩增后,建立MCB共250管(P3代)、WCB共250管(P5代),每管均4×10~6个hUCMSCs。MCB和WCB细胞均高表达CD73、CD90、CD105,低表达CD34、CD45、CD14、CD79a和HLA-DR;染色体稳定、无体外致瘤性。将WCB细胞取出复苏扩增1代后移植T1D大鼠,6周内,大鼠血糖水平较对照组(注射等量生理盐水)显著下降(P0.05),且体重下降缓慢(P0.05);6周后,与对照组相比,移植组大鼠胰岛组织形态明显恢复,肝脏合成葡萄糖转运蛋白能力提高。结论采用二次贴壁法获得的hUCMSCs所建立的MCB和WCB细胞生物特性一致,且具有良好的安全性。初步移植结果预示,T1D大鼠GLUT蛋白表达提高可能与hUCMSCs改善肝脏糖原合成能力有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离培养及鉴定的方法 ,为MSCs的系列研究奠定基础。方法采用全骨髓直接贴壁筛选法分离培养MSCs并传代,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以MTT法检测细胞增殖水平并绘制生长曲线。取第3代MSCs,流式细胞术检测细胞周期和细胞表型,应用成骨细胞诱导液和脂肪样细胞诱导液诱导MSCs定向分化,鉴定其分化能力。结果全骨髓细胞培养5d,镜下可见贴壁细胞增殖明显,细胞形态较均一,大部分呈梭形,7d左右可传代,经2～3次传代后细胞呈单一梭形的成纤维样细胞,即MSCs;细胞生长曲线呈S形;经流式细胞仪检测,MSCs细胞76.01%处于G0/G1期,7.13%处于G2/M期,16.86%处于S期;MSCs表面不表达CD34;在特定诱导液作用下,MSCs可分别向成骨样细胞及脂肪样细胞分化。结论已成功建立了分离培养及鉴定MSCs的方法 ,可用来评价体外培养的MSCs。     

人胎盘来源的造血干细胞和间充质干细胞的分离及鉴定

目的建立人胎盘来源的造血干细胞(placenta hematopoietic stem cells,hP-HSCs)和间充质干细胞(placentaderived mesenchymal stem cells,hP-MSCs)的分离方法,并进行鉴定和组分分析。方法选取10份新生健康婴儿胎盘组织,采用机械破碎法联合磁珠分选法分离h P-HSCs,胎盘绒毛膜组织块贴壁法分离hP-MSCs,利用形态学观察、集落培养、流式细胞术等进行鉴定。结果 hP-HSCs:分离后有核细胞数(total nucleated cell number,TNC)为(11. 82±2. 46)×10~8个,TNC回收率≥80%;细胞活性为(99. 7±0. 3)%;细胞表面抗体CD34~+CD45dim表达率为(8. 69±0. 36)%,CD34~+总数为(108. 0±6. 48)×10~6个;集落形成总数为(1. 88±1. 07)×10~6。hP-MSCs:冻存细胞总数为(40. 78±9. 35)×10~7个;细胞活性为(99. 0±1. 5)%;细胞表面抗体CD34~+CD45~+表达率为(0. 1±0. 1)%,CD44~+CD105~+为(99. 6±0. 2)%,CD14~+CD19~+为(0. 1±0. 1)%,CD90~+CD73+为(98. 9±0. 2)%;且具有良好成脂、成骨分化潜能。结论成功建立了hP-HSCs和hP-MSCs体外分离培养方法,为胎盘的临床应用奠定了基础,并提供了细胞种子资源。     

骨髓间充质干细胞对大鼠胰腺损伤组织的修复作用

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠胰腺损伤组织的修复作用。方法应用贴壁法分离、纯化、扩增大鼠MSCs,经流式细胞仪检测其细胞周期及表面标志后,用DAPI标记,经尾静脉注入胰腺损伤模型大鼠体内,15d后,在激光共聚焦显微镜下观察MSCs在大鼠胰腺组织的定位,组织病理切片观察胰腺损伤组织的病理改变,PCR检测胰腺损伤区组织的Sry基因。结果体外纯化、扩增、富集的MSCs经流式细胞仪检测,86.67%的细胞处于G0/G1期,细胞表面CD34呈阴性表达,CD44呈阳性表达。DAPI标记的MSCs移植治疗15d后,激光共聚焦显微镜下可见,MSCs在损伤的胰腺组织中多见,在正常胰腺组织中偶见;组织病理切片可见损伤的胰腺组织结构开始恢复,胰岛再建;PCR结果显示,治疗组胰腺组织可扩增出Sry基因。结论MSCs对大鼠胰腺损伤组织可能具有修复作用。     

一种分离培养人脐带Wharton's jelly间充质干细胞的新方法

目的探讨一种分离培养人脐带Wharton′s jelly间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的新方法。方法取人脐带组织,除去动静脉后剪碎成2～5 mm3,将组织碎片浸入4 g/LⅠ型胶原酶和1 g/L透明质酸酶的混合液中,于37℃处理1 h,再用0.25%胰蛋白酶在相同条件下消化30 min,得到的消化液经70μm细胞滤网过滤后,制备单个细胞悬液,培养并传代。取P1、P3、P7代脐带Wharton′s jelly MSC,绘制细胞生长曲线;取P3代细胞,采用流式细胞术检测细胞表面标记分子,并分别采用成骨和成脂诱导培养基进行成骨及成脂诱导分化,茜素红染色和油红O染色观察结果。结果 P1、P3代脐带Wharton′s jelly MSC的增殖能力强,且P1代细胞的增殖能力强于P3代,P7代细胞的增殖能力较P3代细胞有所减弱。P3代脐带Wharton′s jelly MSC高表达CD90(99.8%)、CD105(100%)和CD166(100%),低表达CD45(0.3%)、CD14(0.1%)、CD34(0.2%)和CD79a(0.3%),不表达HLA-DR。P3代Wharton′s jellyMSC经成骨诱导后,茜素红染色可见红色结节;经成脂诱导后,油红O染色可见脂质沉积。结论本方法获得的Wharton′s jelly MSC活性好,增殖能力强,为后续实验研究及临床应用提供了理想的种子细胞。     

兔脂肪间充质干细胞胰岛素分泌功能的体外诱导

目的研究兔脂肪间充质干细胞体外诱导分化为具有胰岛素分泌功能的细胞的可能性。方法采用贴壁法分离兔脂肪间充质干细胞,培养、传代后,以胰高糖素样多肽(GLP-1)和尼克酰胺作为诱导剂进行诱导分化。对诱导后的细胞进行双硫腙染色及葡萄糖刺激胰岛素分泌试验,ELISA法检测胰岛素含量。结果细胞诱导后逐渐聚集成细胞团,双硫腙染色呈砖红色,诱导后第14天培养液中可检测到胰岛素,第21天浓度较14d增高,高糖组[(21.5±1.6)μIU/ml]比低糖组[(18.1±2.5)μIU/ml]略高,且差异有显著意义。结论兔脂肪间充质干细胞在体外一定诱导条件下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能。     

骨髓间充质干细胞对胰腺损伤模型大鼠血清生化指标的影响

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对胰腺损伤模型大鼠血清生化指标的影响。方法胰腺结扎建立大鼠胰腺损伤模型;体外分离纯化及培养大鼠的MSCs,流式细胞术检测细胞周期及细胞表面标志,经尾静脉回输治疗胰腺损伤,逐日观察,并于回输后24h、48h、7d和15d,分别采血,分离血清,检测血淀粉酶与脂肪酶含量。结果分离纯化的MSCs细胞周期中,86.67%处于G0/G1期,表达MSCs表面标志CD44,不表达造血干细胞表面标志CD34。治疗组在回输MSCs15d后,肉眼可见坏死的胰腺组织外观基本恢复正常,24h、48h和7d,血清淀粉酶含量均低于模型组,且差异有统计学意义,在15d时接近于模型组,差异无统计学意义;在24h、48h、7d和15d时,治疗组血清中脂肪酶含量均低于模型组,且差异有统计学意义;24h、48h、7d和15d,治疗组血清中血淀粉酶和脂肪酶含量仍高于正常对照组,且差异有统计学意义。结论骨髓间充质干细胞对胰腺组织损伤的模型大鼠具有治疗作用。     

大鼠脂肪干细胞两种培养方法的比较

目的采用组织块培养法和胶原酶消化法体外培养大鼠脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs),并对两种培养方法进行比较分析。方法分离SD大鼠腹股沟处脂肪组织,分别采用组织块培养法和胶原酶消化法获取ADSCs,并对其进行原代培养和传代培养,观察细胞形态,比较细胞的产量和增殖能力;分别用化学成脂诱导剂和化学成骨诱导剂诱导ADSCs分化,观察其分化情况,并计算成脂量。结果组织块培养法和胶原酶消化法培养ADSCs的成功率分别为79%和53%,获得的第4代ADSCs多为成纤维细胞样,长梭形或纺锤形,无形态学差异,传至第8代,细胞生长状态良好,传代后细胞性状均一,生物学特性稳定;培养第7天,组织块培养法每毫克脂肪组织获得的细胞产量高于胶原酶消化法,差异有统计学意义(P0.05);第4代ADSCs生长曲线均为相似的"S"型,细胞倍增时间分别为96.56和95.84 h;ADSCs均可向脂肪细胞和骨细胞方向分化,培养第7天,两组间成脂量差异无统计学意义(P0.05)。结论脂肪组织块培养法是更适合的体外获取ADSCs的方法。