体外诱导微环境对骨髓间充质干细胞成神经分化的影响及分化后的自发逆转现象

目的体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)成神经分化,并探讨诱导微环境对其分化的影响及分化后的自发逆转现象。方法体外分离培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志。采用改良神经元诱导液[Modified neuronal induction media(MNM)]定向诱导MSCs,免疫荧光检测神经细胞表面标志。观察胎牛血清(FBS)浓度、细胞密度、MNM剂量、新鲜与使用过的MNM等不同诱导微环境对MSCs成神经分化的影响。结果 MSCs经MNM诱导后,6h即可见尼氏体,表达神经元特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和微管相关蛋白-2(MAP-2)。随着诱导微环境的改变,MSCs成神经分化率及神经元表面标志表达亦发生改变,且分化后的神经元样细胞可自发逆转。结论 MSCs能够在MNM微环境中定向成神经分化,但诱导微环境的改变可以从量和质两个层面影响MSCs定向分化。     

改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞

目的采用改良组织块贴壁法制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)。方法无菌条件下取足月婴儿脐带,采用改良组织块贴壁法分离间充质干细胞,台盼蓝染色法计数单个核细胞数,倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期及免疫表型。结果原代hUCMSCs的数量为(1~5)×105个。培养至8 d,组织块边缘处有单细胞爬出;培养至2周,贴壁生长的细胞散在分布或形成小克隆;培养至20 d,细胞呈梭型、三角形或多角形。培养第20天的原代hUCMSCs的G0/G1期细胞占88.12%,S期细胞占1.23%,G2/M期细胞占10.65%,大多数细胞处于细胞增殖的潜伏期,CD105阳性率为97.65%,CD34阳性率为2.54%。结论采用改良组织块贴壁法分离了hUCMSCs,其生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,为其临床应用奠定了基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的定向诱导分化

目的 探讨肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)和碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growthfactor,bFGF)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)分化为肝样细胞的可行性。方法取SD大鼠股骨骨髓,直接贴壁法分离纯化BM-MSCs,并体外传代,流式细胞术和成骨诱导对其进行鉴定。取第3代BM-MSCs,分为2组:实验组用HGF(20 ng/ml)和bFGF(10 ng/ml)进行诱导,阴性对照组不加诱导剂,倒置显微镜下观察细胞形态变化;RT-PCR法检测诱导后细胞甲胎蛋白(Alpha fetoprotein,AFP)和白蛋白(Albumin,ALB)基因mRNA的转录水平;免疫细胞化学染色法检测诱导后细胞的AFP和ALB蛋白的表达。结果第3代BM-MSCs表型标志和功能特性均符合MSCs的特点。BM-MSCs经HGF和bFGF诱导后呈肝样细胞形态。实验组细胞可检测出AFP和ALB基因mRNA的表达。实验组细胞诱导后第7天,AFP蛋白开始表达,第14天时表达降低,第21天时不表达;ALB于诱导后第14天出现表达,并随诱导时间的延长表达逐渐增加。结论 HGF和bFGF具有体外诱导BM-MSCs向肝样细胞分化的作用。     

bFGF促增殖后骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞的分化

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)体外作用于骨髓间充质干细胞(Mesen-chymal stem cells,MSCs)后,诱导其向神经元样细胞和多巴胺能神经元样细胞定向分化的情况。方法从鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,用MTT法检测bFGF对骨髓MSCs生长的影响。10 ng/ml bFGF作用2 d后,通过IBMX、细胞因子bFGF、GDNFI、L-1β、中脑神经胶质细胞条件培养基和中脑神经细胞膜碎片等分组联合诱导骨髓MSCs向神经元样细胞、多巴胺能神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法鉴定特异标志NSE、MAP-2a,b和TH的表达。结果在一定范围内,bFGF对骨髓MSCs具有明显的促增殖作用。分化的神经元样细胞表达NSE、MAP-2a,b和TH,联合应用GDNFI、L-1β、中脑条件培养基和中脑神经细胞膜碎片诱导7 d后,NSE阳性率为(27.774±2.747)%,MAP-2a,b为(28.006±3.080)%,TH为(3.098±0.352)%。结论体外骨髓MSCs被诱导分化成神经元样细胞和多巴胺能神经元样细胞,为帕金森等中枢神经系统疾病的细胞移植治疗奠定了基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞向成骨与成脂分化过程中相关基因的表达变化

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨与成脂分化过程中相关基因表达的变化。方法采用全贴壁法分离培养大鼠BMSCs,并观察其形态学特征的变化,MTT法检测其生长状况,并绘制生长曲线。分别采用成骨和成脂诱导剂对第4代BMSCs进行诱导分化,应用碱性磷酸酶试剂盒、茜素红和油红O染色液检测其ALP活性、成骨和成脂分化能力;RT-QPCR检测诱导0、7、14和21 d的成骨分化相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、碱性磷酸酶(ALP)及成脂分化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxidase proliferator activated receptor gamma,PPARγ)和脂肪酸结合蛋白(FABP4)的表达变化。结果全骨髓贴壁法能成功分离培养BMSCs,传代细胞生长增殖迅速,以长梭形细胞生长为主,细胞生长曲线呈S形。第4代BMSCs分别经成骨和成脂诱导剂诱导后,ALP、茜素红和油红O染色均呈阳性;诱导7、14和21 d后,Runx2、OCN、ALP、PPARγ和FABP4基因mRNA的表达量均显著高于0 d(P0.05);成骨分化过程中,Runx2和ALP在第7天时表达量最高,之后呈下降趋势,OCN的表达量呈稳定上升趋势;成脂分化过程中,PPARγ在第7天时表达量最高,FABP4始终高表达。结论 BMSCs具有易于体外分离培养、扩增和经诱导后具有多向分化潜能等特点,成骨和成脂分化相关基因的表达量随诱导时间延长而变化,呈明显的时序性表达差异,提示分别在成骨与成脂分化过程中起重要调控作用,为BMSCs在骨、细胞和基因等工程中的机制研究提供了实验依据。     

兔骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定

目的探讨兔骨髓基质干细胞(MSC)体外分离培养及鉴定。方法自兔髂骨抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离纯化出MSC,并增殖。观察MSC的生长情况及形态学特点,流式细胞仪检测第3代MSC表面抗原的表达情况。结果体外培养的兔MSC贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆;MSC阳性表达CD29,CD90,但CD34,CD45呈阴性。结论利用密度梯度离心法获取的MSC具有大量增殖的能力,表达CD29,CD90,不表达CD34,CD45。     

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞的分化

目的探讨乳鼠视网膜细胞条件分化液诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)的神经分化情况,以期为视网膜退行性疾病提供治疗方案。方法体外分离培养Wistar大鼠乳鼠BMSCs,观察BMSCs的增殖情况并进行鉴定;制备乳鼠视网膜细胞条件分化液,以其诱导BMSCs,观察BMSCs的神经分化情况,并行免疫组化鉴定。结果体外培养获得了较纯的BMSCs;在乳鼠视网膜细胞条件分化液的环境中,诱导后72h,BMSCs胞体收缩成锥形或球形,细胞突起变细、变长,呈神经细胞的典型形态;免疫组化结果显示,部分细胞呈神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)和Thy1.1阳性反应。结论乳鼠视网膜细胞条件分化液可诱导BMSCs分化成视网膜神经节样细胞。     

白藜芦醇体外诱导大鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞的分化

目的研究白藜芦醇体外诱导大鼠骨髓基质细胞(Marrow stroma cells,MSCs)向神经元样细胞的分化。方法采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs,取第3代MSCs分为白藜芦醇诱导组、对照组和正常组,白藜芦醇诱导组先加入预诱导液(含10μg/L bFGF的DMEM/F12培养基)培养24 h,再更换诱导液(含15μmol/L白藜芦醇的DMEM/F12培养基)诱导6 h,然后更换维持液(含15μmol/L白藜芦醇,10μg/L bFGF,2%B27的DMEM/F12培养基),继续培养至72 h;对照组预诱导与白藜芦醇诱导组相同,诱导时仅加入DMEM/F12培养基诱导6 h,再更换维持液(含10μg/L bFGF,2%B27的DMEM/F12培养基),继续培养至72 h,倒置显微镜下观察诱导分化后MSCs形态;各组分别于诱导前及诱导后2、6、24、72 h采用间接免疫荧光法、Western blot法和RT-PCR法检测nestin、NSE蛋白及mRNA表达。结果白藜芦醇诱导后细胞胞体收缩,伸出长突起,类似神经元,间接免疫荧光染色显示诱导后细胞nestin和NSE阳性,对照组未见阳性细胞。白藜芦醇诱导组nestin、NSE蛋白及mRNA表达较对照组明显升高,诱导后2 h,nestin蛋白及mRNA表达达最高(P<0.01),之后逐渐下降;而NSE蛋白及mRNA表达逐渐升高,诱导后72 h达最高(P<0.01),对照组则无明显变化。结论白藜芦醇在体外可诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞,为白藜芦醇在干细胞移植领域的应用提供了实验依据。     

骨髓间充质干细胞对大鼠胰腺损伤组织的修复作用

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠胰腺损伤组织的修复作用。方法应用贴壁法分离、纯化、扩增大鼠MSCs,经流式细胞仪检测其细胞周期及表面标志后,用DAPI标记,经尾静脉注入胰腺损伤模型大鼠体内,15d后,在激光共聚焦显微镜下观察MSCs在大鼠胰腺组织的定位,组织病理切片观察胰腺损伤组织的病理改变,PCR检测胰腺损伤区组织的Sry基因。结果体外纯化、扩增、富集的MSCs经流式细胞仪检测,86.67%的细胞处于G0/G1期,细胞表面CD34呈阴性表达,CD44呈阳性表达。DAPI标记的MSCs移植治疗15d后,激光共聚焦显微镜下可见,MSCs在损伤的胰腺组织中多见,在正常胰腺组织中偶见;组织病理切片可见损伤的胰腺组织结构开始恢复,胰岛再建;PCR结果显示,治疗组胰腺组织可扩增出Sry基因。结论MSCs对大鼠胰腺损伤组织可能具有修复作用。     

细胞传代对骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化的影响

目的 观察在成软骨诱导培养条件下,细胞传代对骨髓间充质干细胞(MSCs)体外成软骨能力的影响.方法 不同代MSCs成软骨诱导后,观察细胞生物学特性以及通过免疫荧光,RT-PCR测定特异性软骨细胞外基质aggrecan的表达情况.结果 经成软骨诱导后,第2、4代MSCs表达aggrecan明显较第6、8代细胞高.结论 MSCs很可能由多种形态功能接近,分化潜能有略有差异的细胞组成;在成软骨诱导培养条件下,对此传代后成软骨能力减弱.     

Effect of essential and nonessential amino acid compositions on the in vitro behavior of human mesenchymal stem cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow appear to be an attractive tool for use in tissue engineering and cell-based therapies due to their multipotent capacity. The majority of studies on MSCs have been restricted to the roles of growth factors, cytokines, and hormones. Based on previous reports demonstrating the important roles of amino acids, we sought to evaluate the effect of essential amino acids (EAs) and nonessential amino acids (NEAs) on the proliferation and differentiation of MSCs. The results showed that the EA/NEA compositions during culture could significantly modulate MSC proliferation and differentiation and, especially, that EAs served as a potent positive modulator in the proliferation of MSCs without causing a deficit in the differentiation capacity of the cells. These results will be very useful in the production of MSC-based cell therapy products for use in the field of tissue engineering and regenerative medicine.     

一种分离培养人脐带Wharton's jelly间充质干细胞的新方法

目的探讨一种分离培养人脐带Wharton′s jelly间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的新方法。方法取人脐带组织,除去动静脉后剪碎成2～5 mm3,将组织碎片浸入4 g/LⅠ型胶原酶和1 g/L透明质酸酶的混合液中,于37℃处理1 h,再用0.25%胰蛋白酶在相同条件下消化30 min,得到的消化液经70μm细胞滤网过滤后,制备单个细胞悬液,培养并传代。取P1、P3、P7代脐带Wharton′s jelly MSC,绘制细胞生长曲线;取P3代细胞,采用流式细胞术检测细胞表面标记分子,并分别采用成骨和成脂诱导培养基进行成骨及成脂诱导分化,茜素红染色和油红O染色观察结果。结果 P1、P3代脐带Wharton′s jelly MSC的增殖能力强,且P1代细胞的增殖能力强于P3代,P7代细胞的增殖能力较P3代细胞有所减弱。P3代脐带Wharton′s jelly MSC高表达CD90(99.8%)、CD105(100%)和CD166(100%),低表达CD45(0.3%)、CD14(0.1%)、CD34(0.2%)和CD79a(0.3%),不表达HLA-DR。P3代Wharton′s jellyMSC经成骨诱导后,茜素红染色可见红色结节;经成脂诱导后,油红O染色可见脂质沉积。结论本方法获得的Wharton′s jelly MSC活性好,增殖能力强,为后续实验研究及临床应用提供了理想的种子细胞。     

自组装多肽水凝胶支架中MSCs的三维培养及成骨分化

使用一种新型人工设计自组装多肽(RADA16)水凝胶作为三维培养支架评价MSCs成骨分化情况。将人骨髓MSCs培养增殖后接种到水凝胶中,在成骨分化培养液中进一步培养1～3周。荧光染色法观察细胞形态和存活情况;组织学染色检测MSCs ALP活性;半定量RT-PCR分析成骨特异性基因的表达。绝大多数MSCs在水凝胶支架内能够存活,呈纺锤样形态。诱导培养后蛋白和基因表达水平均检测到ALP活性,在14天时达到峰值。骨晚期分化特异性基因BSP也有表达,且表达量随培养时间延长而增多。自组装多肽水凝胶为MSCs的黏附生长及向成骨细胞分化提供良好的三维微环境,有望成为极具吸引力的骨组织工程支架材料。     

人乳腺癌相关成纤维细胞的原代培养及其生物学特性

目的原代培养人乳腺癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblast,CAF),并检测其生物学特性。方法采用胶原酶消化培养法对26份乳腺癌患者标本进行原代细胞分离培养,倒置显微镜下观察人乳腺癌CAF的形态学特性,免疫荧光染色法鉴定所分离培养的人乳腺癌CAF纤维连结蛋白(Fibronectin,FN)和成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activated protein,FAP)的表达,并通过MTT法和细胞计数法绘制细胞生长曲线。结果胶原酶消化法的最适酶浓度为0.12%,最适消化时间为10 h。原代培养23份成功,3份失败。培养成功的细胞贴壁生长,形态完整,生长状态良好,背景清晰,有明显的对数生长期,并可传代培养。培养的细胞FN和FAP表达阳性,表明原代培养的CAF为乳腺癌CAF。结论胶原酶消化培养法适合人乳腺癌CAF的原代培养,通过该方法可建立理想的人乳腺癌CAF体外实验模型。     

小鼠骨髓间充质干细胞对异基因肝移植大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用

目的观察小鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植后,在异基因肝移植模型大鼠胸腺、脾脏及骨髓中的迁徙、定居情况及对淋巴细胞增殖的抑制作用,以探讨MSCs诱导异基因移植免疫耐受的可能性。方法体外分离、纯化并培养小鼠MSCs;将小鼠肝组织块埋入大鼠肝脏切口,建立异基因肝移植大鼠模型;经尾静脉移植DAPI标记的小鼠MSCs,通过激光共聚焦显微镜观察24 h及5 d时,MSCs在模型大鼠胸腺、脾脏及骨髓内的迁徙及定居;采用体外淋巴细胞增殖实验检测小鼠MSCs对异基因肝移植大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用。结果MSCs移植后,24 h即散在分布于胸腺、脾脏及骨髓内,5 d时集中在血管周围;经MSCs治疗后,大鼠胸腺和脾脏淋巴细胞增殖均受到抑制,与未经治疗的模型大鼠相比,差异有显著意义。结论小鼠MSCs可迁徙至异基因肝移植大鼠免疫器官内,并具有抑制淋巴细胞增殖的作用。     

Enhancing Osteoconduction of PLLA-Based Nanocomposite Scaffolds for Bone Regeneration Using Different Biomimetic Signals to MSCs

In bone engineering, the adhesion, proliferation and differentiation of mesenchymal stromal cells rely on signaling from chemico-physical structure of the substrate, therefore prompting the design of mimetic "extracellular matrix"-like scaffolds. In this study, three-dimensional porous poly-L-lactic acid (PLLA)-based scaffolds have been mixed with different components, including single walled carbon nanotubes (CNT), micro-hydroxyapatite particles (HA), and BMP2, and treated with plasma (PT), to obtain four different nanocomposites: PLLA + CNT, PLLA + CNTHA, PLLA + CNT + HA + BMP2 and PLLA + CNT + HA + PT. Adult bone marrow mesenchymal stromal cells (MSCs) were derived from the femur of orthopaedic patients, seeded on the scaffolds and cultured under osteogenic induction up to differentiation and mineralization. The release of specific metabolites and temporal gene expression profiles of marrow-derived osteoprogenitors were analyzed at definite time points, relevant to in vitro culture as well as in vivo differentiation. As a result, the role of the different biomimetic components added to the PLLA matrix was deciphered, with BMP2-added scaffolds showing the highest biomimetic activity on cells differentiating to mature osteoblasts. The modification of a polymeric scaffold with reinforcing components which also work as biomimetic cues for cells can effectively direct osteoprogenitor cells differentiation, so as to shorten the time required for mineralization.