替换稀有密码子提高HBsAg在CHO细胞中的表达量

目的　通过替换S基因稀有密码子 ,提高HBsAg在CHO细胞中的表达量。方法　利用重叠PCR技术 ,将S基因上 3个稀有密码子替换成哺乳动物细胞偏爱的密码子 ,得到Sm 基因。把S和Sm 基因分别克隆到pCI载体上 ,并转染CHO(dhfr )细胞 ,利用ELISA方法检测HBsAg的表达量。结果　获得预期的Sm 基因。在CHO细胞中 ,Sm 基因表达量明显高于S基因。结论　替换S基因稀有密码子可以提高HBsAg的表达量     

高效表达乙型肝炎表面抗原的CHO工程细胞株的构建

目的构建高效表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的CHO工程细胞株。方法从pCIneo质粒出发,构建含有改造了稀有密码子的HBsAgS基因和启动子弱化的二氢叶酸还原酶(DHFR)转录单位的新型表达载体,利用脂质体转染CHO/dhfr-细胞,经3轮氨甲喋呤(MTX)梯度加压筛选和单克隆筛选,获得高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,并对HBsAg的分泌动态进行检测。结果所构建的新型表达载体pCI-DS经PCR及酶切鉴定,证明构建正确,转染CHO/dhfr-细胞后,经筛选得到高效表达HBsAg的CHO工程细胞株3F9,表达量达9.21μg/106个细胞·48h。单层细胞培养动态表明,3F9株细胞能在40d内稳定高效表达HBsAg。结论已成功构建稳定高效表达HBsAg的CHO工程细胞株,为提高HBsAg的产量创造了条件。     

抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建

目的构建抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体杆状病毒表达载体。方法用PCR方法扩增抗HBsAg抗体Fab片段的轻链(L)及重链Fd段(VH+CH1)基因片段,将杆状病毒载体pAC-k-Fc与L基因连接,重组为过渡表达载体pAC-k-L-Fc,再与Fd基因连接,构建重组表达载体pAC-HBs-Fc,并进行酶切鉴定及DNA测序分析。确定正确后,转染昆虫细胞sf9,用免疫荧光检测IgG的表达。结果PCR扩增的片段约650bp,与预期值一致。载体pAC-k-L-Fc和pAC-HBs-Fc的酶切片段和DNA序列与预期结果一致。转染sf9细胞呈阳性荧光反应,未转染细胞呈阴性荧光反应。结论已成功构建表达载体pAC-HBs-Fc,为表达抗人HBsAg的IgG全抗体奠定了基础。     

应用载体介导的RNAi技术抑制HBsAg在重组CHO细胞中的表达

目的应用载体介导的RNA干扰技术,特异地干扰重组CHO细胞中乙型肝炎病毒s基因的表达。方法设计两段靶向HBV s基因的特异性siRNA,合成两对64nt寡核苷酸,插入载体H1启动子下游,构建表达干扰性发夹状RNA(Short hairpin RNA,shRNA)的载体pHs-9和pHs-170,转染重组CHO细胞(该CHO细胞整合了HBV s基因,可稳定表达s抗原),用ELISA法检测HBsAg的表达。结果pHs-9和pHs-170转染重组CHO细胞后24~120h,在细胞培养上清中检测到HBsAg表达降低,抑制率均达到70%左右。结论pHs-9和pHs-170已成功地表达了发夹状siRNA,并抑制了重组CHO细胞中HBsAg的表达。     

绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　构建绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因的载体 ,并检测其在COS 7细胞中的表达。方法　采用PCR获得HBsAg基因 ;利用该基因片段和质粒pEGFP 3.1的HindⅢ /KpnⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pGHBs 3.1;通过脂质体介导的方法将该载体转染到COS 7细胞中 ,用PCR法检测基因转染 ,ELISA检测HBsAg的瞬时表达 ,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果　融合表达载体pGHBs 3.1转染COS 7细胞后 ,在细胞中检测到HBsAg基因片段 ,转染细胞培养上清中检测到HBsAg表达 ,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论　表达载体pGHBs 3.1在COS 7细胞中获得了表达 ,表达的融合蛋白具有HBsAg和绿色荧光蛋白的双重活性 ,该载体可用绿色荧光蛋白作为报告基因观察HBsAg的表达及定位。     

双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。     

人丙酮酸羧化酶异位表达提高中国仓鼠卵巢细胞补料分批培养后期活率

构建了人丙酮酸羧化酶(hPC)异位表达的重组CHO细胞,并检测了重组细胞生长情况的改变。利用分子生物学实验技术构建hPC-pcDNA 3.0表达载体,将其转染CHO-K1细胞;转染细胞经过G418抗性筛选后,通过荧光定量PCR检测目的基因表达,并挑选表达量最高的克隆进行补料分批培养。电泳及测序结果显示,构建的hPC-pcDNA3.0表达载体序列与预期一致;在mRNA水平鉴定目的基因显示,4#克隆的mRNA表达水平最高;选其进行补料分批培养,生长曲线显示在培养后期,其活细胞密度和细胞活率均高于对照。成功构建了细胞生长和活率改善的重组CHO细胞,获得了生长改善的细胞株,为后续的重组蛋白表达研究与细胞培养工艺优化奠定了基础。     

瓣状内切核酸酶1基因重组真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建瓣状内切核酸酶1(Flap endonuclease 1,FEN1)基因重组真核表达质粒,并进行鉴定。方法提取L02细胞总RNA,逆转录合成cDNA,经巢式PCR扩增FEN1基因,定向克隆至载体pcDNA3.1,构建重组真核表达质粒,经酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的真核表达质粒转染293T细胞,Western blot检测FEN1蛋白的表达。结果 FEN1基因重组真核表达质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;在相对分子质量约47 000处可见目的蛋白条带,转染细胞中FEN1蛋白表达量较空载体转染组及空白细胞对照组提高约3倍。结论已成功构建了FEN1基因重组真核表达质粒,并可在293T细胞中过表达FEN1。     

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。方法RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平。结果经双酶切及PCR鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录。结论已成功构建了FMDV2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。     

颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达

目的提高乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在人参愈伤组织细胞中的表达。方法构建一种植物细胞表达载体pBIBeo,该载体携带CaMV 35S双增强启动子和TMV(U1株)翻译增强子。用pBIBeo转化的农杆菌LBA4404与人参愈伤组织细胞共培养,经G418筛选获得新生抗性细胞团PBIBeo,连续继代培养选育出用于植物源口服乙肝疫苗生产的高产细胞株。提取基因组DNA和mRNA,进行PCR和RT-PCR鉴定,Western blot鉴定HBsAg的特异性,电镜下观察纯化抗原颗粒大小,并以ELISA检测HBsAg的表达水平。结果转化的人参细胞基因组DNA进行PCR反应,得到约700 bp的启动子基因片段。提取mRNA进行RT-PCR反应,得到约700 bp的HBsAg基因片段。Western blot分析可见相对分子质量为24 000的特异性条带。亲和层析纯化细胞表达的HBsAg抗原,电镜观察可见平均直径为32 nm的颗粒。ELISA检测结果表明pBIBeo转化细胞株HBsAg表达量比pBIBSa转化细胞株提高1~2倍。结论人参细胞基因组已经整合了目的基因并稳定高效表达。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在CHO细胞中的稳定表达

目的在CHO细胞中稳定表达水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)。方法PCR扩增VZVgE完整胞外结构域编码基因,克隆至哺乳动物细胞表达质粒PSGHVO中,与DHFR选择性基因和脂质体共转染CHO/dhfr-细胞,筛选稳定分泌人生长激素(hGH)和gE融合蛋白的细胞株。采用ELISA和Western blot方法检测细胞培养上清中hGH和gE融合蛋白的表达,并用Ni2+-NTA柱进行纯化。结果gE基因PCR扩增产物和重组表达质粒PSGHVO-gE的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳,均可见1500bp的目的基因条带。转染PSGHVO-gE质粒和DHFR基因的细胞培养上清液经ELISA和Western blot,确认有重组蛋白表达,gE表达量约为20mg/L;纯化后蛋白纯度约为90%。结论已在CHO细胞中稳定表达了VZVgE蛋白,为制备VZV表面抗原奠定了基础。     

稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立

目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。     

汉坦病毒SEO型S基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的构建汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体。方法应用RT-PCR方法扩增汉坦病毒SEO型的YZG-Changchun株S基因,克隆至pMD18-T载体中,经酶切鉴定及PCR分析后,定向克隆入原核表达载体pET-28a中,转化E.coliRosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析外源蛋白的表达情况。结果表达载体经双酶切和测序证明构建正确。IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导4.5 h时,S基因在原核细胞中得到了高效表达,表达的蛋白占菌体蛋白总量的37%,纯化后的蛋白具有良好的抗原活性。结论已成功构建了汉坦病毒SEO型S基因原核表达载体,并得到高效表达。     

人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定

目的对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定。方法用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体。以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析。结果上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%。经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体。CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与E.coli表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%。结论人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达。