酶催化制备p-羟基苯乙基β-D-葡萄糖苷过程强化

以亲水性固体材料吸附p-羟基苯乙醇的形式以及补加葡萄糖方式,通过β-葡萄糖苷酶在水-1,2-二乙酰氧基乙烷体系中催化P-羟基苯乙醇直接糖基化反应制备P-羟砖苯乙基β-D-葡萄糖苷.当硅藻土吸附p-羟基苯乙醇的吸附量为0.06mol·g-1,体系水分活度(aw)0.78,52℃,pH 6.2时,在p-羟基苯乙醇为0.6mol.L-1,与葡萄糖摩尔比为3的条件下,反应24 h,反应产率达25.63%,产物浓度为O.05l mol.L-1;采取反应后期补加葡萄糖到初始浓度,继续反应24 h,总反应产率达40.15%,产物总浓度为0.101 mol·L-1.而两次补加的总反应产率达41.10%,产物总浓度为0.124 mol·L-1.实验结果表明,吸附形式P-羟基苯乙醇和补加葡萄糖两种方式对在水-1,2-二乙酰氧基乙烷体系中的酶催化直接糖基化反应过程都具有明显的强化作用.     

特殊反应体系中交联β-葡萄糖苷酶聚集体催化合成红景天苷

采用具有较高操作稳定性的交联b-葡萄糖苷酶聚集体,在离子液体-混合有机溶剂-缓冲溶液的非常规反应体系中酶催化直接糖基化合成红景天苷,筛选反应体系的组成和各成分的比例. 结果表明,反应体系的组成为(%, j)：1,4-二氧六环42.5, 离子液体C4MIm×PF6 8.5, 乙酸乙酯34, pH 6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液15.0. 该体系在水含量高达15%(j)的条件下水活度为0.66,适合直接糖基化反应. 底物b-D-葡萄糖100 g/L、对羟基苯乙醇200 g/L时,在50℃及250 r/min下反应120 h达到平衡,红景天苷最大浓度可达25.32 g/L.     

两相体系中β-葡萄糖苷酶催化栀子苷水解制备京尼平

京尼平是一种天然生物交联剂,且具有多种生理活性。本文以β-葡萄糖苷酶催化栀子苷水解制备京尼平为目标体系,证明了京尼平对β-D-葡萄糖苷酶具有竞争性抑制作用;考察了β-D-葡萄糖苷酶在不同有机相-水体系中的稳定性,发现其在正辛醇-水、正己醇-水体系中的稳定性均较好;测定了栀子苷在正辛醇-水和正己醇-水体系中的分配系数kD,gardenoside分别为0.17和0.76,而京尼平的分配系数kD,genipin为42.57和37.75;分别在水、正辛醇-水和正己醇-水体系中进行栀子苷水解制备京尼平的反应,当底物浓度为0.25μmol·ml-1时京尼平收率分别为89.17%、93.96%、90.16%;进一步提高底物浓度为2.0μmol·ml-1时,正辛醇-水体系中京尼平收率高达91.9%,较水相体系(79.7%)提高了12.2%。本文的研究结果证明了采用正辛醇-水两相反应体系可部分解除产物抑制,提高产物收率,并简化后续的产物分离。     

黑曲霉胞内β-葡萄糖苷酶分离提纯及其性质的研究

采用丙酮沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Sephactyl S-200凝胶过滤、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析等步骤,从黑曲霉菌丝体中获得了一种凝胶电泳均一的胞内β-葡萄糖苷酶,其单亚基相对分子质量为122.7K,纯化倍数和得率分别为7.2和19.3%.以纤维二糖为底物时,该酶葡萄糖的抑制常数Ki为0.19 mmol/L,Km值和Vmax分别为2.99 mmol/L、1.49 μmol/min.该酶最适反应温度60℃,最适反应pH为5.0;在60℃以下及pH3～6范围内均能保持稳定.甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂对胞内β-葡萄糖苷酶有很好的激活作用.     

微胶囊固定酶催化合成烷基糖苷的工艺优化

用微球截留固定化和酶催化有机合成技术对β-葡萄糖苷酶固定化及其催化合成烷基糖苷的工艺进行了研究.优化出酶同定化最优上艺为:壁材海藻酸钠4.0%、交联剂戊二醛0.2%、凝聚剂CaCl20.10 mol/L、酶用量140加mg.以固定酶为催化剂、葡萄糖和正丁醇为原料合成烷基糖苷,确定合成的最佳工艺为:正丁醇20 mL、糖醇比2.0:20(g/mL)、固定酶6 g、反应温度40℃,反应时间3 h.得到的固定酶活力比游离酶高,稳定性好,重复使用3次后仍有较好活性.     

皇冠果籽化学成分的分离提取

对皇冠果籽进行了化学成分的分离提取,从中得到了8个化合物,分别是十四碳酸、软脂酸、硬脂酸乙脂、β-胡萝卜苷、4,4’-二羟基-2-甲氧基二苯甲酮-6-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、芒果素、蔗糖.其中4,4’-二羟基-2-甲氧基二苯甲酮-6-O-β-D-葡萄糖苷为首次报道的新化合物。     

β-葡萄糖苷酶高温同步糖化发酵产乙醇应用研究

利用Trichoderma sp.W2所产的嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶及耐高温酵母Kluyveromyces marxianus NCYC 587,以气爆秸秆为原料进行高温同步糖化发酵。研究结果表明:在42℃条件下,接种体积分数10%,底物质量分数15%,发酵pH值为4.8,β-葡萄糖苷酶添加量为30 U/g底物条件下发酵效果最好。NCYC 587能迅速利用预水解产生的葡萄糖发酵并积累乙醇,同时能利用部分木糖,但在发酵后期,葡萄糖利用完全后会代谢利用一定量的乙醇,致使发酵过程中乙醇质量浓度始终维持在一个相对较低的水平。乙醇最高质量浓度达到20.56 g/L,乙醇产率达80.64%。添加嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶于高温同步糖化发酵能有效解决纤维素酶解发酵过程终端产物抑制的难题。     

两相体系中β-葡萄糖苷酶催化栀子苷水解制备京尼平

京尼平是一种天然生物交联剂,且具有多种生理活性。本文以β-葡萄糖苷酶催化栀子苷水解制备京尼平为目标体系,证明了京尼平对β-D-葡萄糖苷酶具有竞争性抑制作用;考察了β-D-葡萄糖苷酶在不同有机相-水体系中的稳定性,发现其在正辛醇-水、正己醇-水体系中的稳定性均较好;测定了栀子苷在正辛醇-水和正己醇-水体系中的分配系数k_{D,gardenoside}分别为0.17和0.76,而京尼平的分配系数k_D,genipin为42.57和37.75;分别在水、正辛醇-水和正己醇-水体系中进行栀子苷水解制备京尼平的反应,当底物浓度为0.25 μmol·ml^-1时京尼平收率分别为89.17%、93.96%、90.16%;进一步提高底物浓度为2.0 μmol·ml^-1时,正辛醇-水体系中京尼平收率高达91.9%,较水相体系（79.7%）提高了12.2%。本文的研究结果证明了采用正辛醇-水两相反应体系可部分解除产物抑制,提高产物收率,并简化后续的产物分离。     

一种新的氨基葡萄糖苷酶检测底物的合成

首次合成了N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测底物-2-氯-4-乙酰基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(CAP-NAG),并对其合成方法进行了研究,最终找到一种操作简便,成本较低,收率较高的合成方法.合成方法如下:以2-氯-4-乙酰基苯酚和氯代乙酰氨基葡萄糖为原料,在丙酮-无水碳酸钾体系中进行缩合反应,得到固体粗品...     

双酶协同水解微波改性木薯淀粉的动力学研究

研究了α 淀粉酶和葡萄糖苷酶协同水解微波改性木薯淀粉的动力学,在单一水解体系中,α 淀粉酶和葡萄糖苷酶对微波改性淀粉颗粒的降解遵循Michaelis Menten方程,葡萄糖苷酶的米氏常数Km=18 718mol/mL,最大反应初速度Vmax=0 745mol/(mL·min),α 淀粉酶的米氏常数Km=88 334mol/mL,最大反应初速度Vmax=1 039mol/(mL·min)。葡萄糖对反应体系具有竞争性抑制剂的作用,其抑制常数Ki=9 656×10-4mol/mL。双酶协同作用的水解效率比单酶作用的水解效率高。     

(2,3-二甲氧基-6-甲酰基)苯基-β-D-葡萄糖苷的合成

为了优化和改进糖苷化反应的合成工艺,首先以β-D-葡萄糖为原料,经乙酰化、溴代反应合成了糖供体2,3,4,6-O-四乙酰基-α-D-溴代葡萄糖(Ⅲ);再与2-羟基-3,4-二甲氧基苯甲醛(Ⅳ)经糖苷化反应合成了2,3,4,6-O-四乙酰基-(2,3-二甲氧基-6-甲酰基)苯基-β-D-葡萄糖苷(Ⅴ);最后对化合物Ⅴ进行水解得到了目标化合物(2,3-二甲氧基-6-甲酰基)苯基-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ)。结果表明:在合成氧糖苷(Ⅴ)的过程中,采用无水K_2CO_3为缚酸剂,四丁基溴化铵(TBAB)为相转移催化剂,反应收率可达78.9%;化合物Ⅴ水解的最优条件是以甲醇为溶剂、无水K_2CO_3为催化剂。所得到产物经核磁、红外、质谱表征,证明为目标化合物。     

黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶过程中pH值的调控

研究了初始pH值对黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的影响,并对产酶过程中pH值进行了人工调控.结果表明,利用黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的最佳初始pH值为5.0;使用氢氧化钠稀溶液能有效地时产酶过程中的pH值进行调控;将产酶期的pH值控制在4.0左右时,有利于β-葡萄糖苷酶的分泌,发酵120 h,酶活力能达到6.12 U·mL-1,大大高于调控前的酶活力.对黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶工艺的制定及提高β-葡萄糖苷酶的产率具有重要的指导作用.     

- 葡萄糖苷酶的研究

研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的影响及β-葡萄糖苷酶的表观酶学性质。麸皮是黑曲霉β-葡萄糖苷酶的较适诱导物。黑曲霉NL02以 40 g/L 麸皮为碳源,在 250 mL 三角瓶中装液 40 mL,接种量 8%,初始pH值5.5, 30℃、 170 r/min 下培养 10 d,β-葡萄糖苷酶活力为 19.12 IU/mL。β-葡萄糖苷酶最适温度为 65℃,40℃ 时稳定性较好;最适pH值为4.8,在pH值3.0～5.0之间稳定性较好。     

含5-甲基异(口恶)唑取代的1,2,4-三唑葡萄糖苷新衍生物的合成

通过4-芳基-5-(5-甲基异(口恶)唑-3-基)-1,2,4-三唑-3-硫醇和α-溴代乙酰葡萄糖在KOH/EtOH体系中进行糖苷化反应,制得4个S-β-D-乙酰葡萄糖苷.后者在饱和氨气的甲醇溶液中水解脱去乙酰基得到4个新的S-β-D-葡萄糖苷.新化合物结构经1HNMR、FAB-MS和元素分析确证.     

1,3-二苯基-3-（苯胺基）-1-丙酮衍生物对α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究

利用Mannich反应合成了24个1,3-二苯基-3-（苯胺基）-1-丙酮衍生物（其中8个为新化合物）,通过测定该系列化合物对α-葡萄糖苷酶活性半抑制浓度来评定其抑制活性,探索化合物分子中苯环上取代基对α-葡萄糖苷酶催化活性的影响。结果表明：新化合物24对α-葡萄糖苷酶的抑制活性稍好,IC50值为57.9μmol.L-1,其余大部分化合物对α-葡萄糖苷酶的IC50值大于100μmol.L-1,说明新化合物24苯环上取代基种类、数目和位置对α-葡萄糖苷酶抑制活性有明显的影响。动力学分析表明该系列化合物为α-葡萄糖苷酶的非竞争性抑制剂。     

纸色谱法筛选知母中α-葡萄糖苷酶抑制剂

采用酶反应、纸色谱和比色相结合法筛选知母中α-葡萄糖苷酶抑制剂。实验条件：1）酶反应：底物浓度10 mg/mL、酶用量为100μL、反应时间8 h;2）纸色谱测定微量葡萄糖：点样量70μL、展开体系正丁醇－丙酮－水（2︰7︰1）、展开方向为径向;3）比色：色谱后苯胺-邻苯二甲酸盐显色,蒸馏水洗脱,比色波长为365 nm。实验结果表明知母水粗提物及其多糖、皂甙、黄酮组分均为α-萄糖苷酶抑制剂,而中草药知母确为优良的降糖植物资源。     

嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶高产菌株及其性质

从生物质资源丰富的武夷山中采样天然腐烂枯枝、烂叶、土壤等材料中分离筛选,采用对硝基酚-β-葡萄糖苷(pNPG)法对复筛菌株进行酶活测定,得到一株高产β-葡萄糖苷酶菌株,并对其酶学性质进行研究,结果表明:该酶的液体发酵最高酶活高达482.1U/mL,最适反应pH值为4.8,最适反应温度为65℃;乙醇浓度为10%对酶活有最大促进作用,对β-葡萄糖苷酶酶活提高将近1倍,乙醇耐受能力高达30%。将该酶应用于同步糖化发酵中,发酵至120h得乙醇最高产量,所产乙醇含量高达41.25g/L,与阴性、阳性对照相比,乙醇产量提高近2倍。该菌株所产的β-葡萄糖苷酶酶活力较高,应用于同步糖化发酵过程具有明显的促进效果,对于促进纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的发展前景。     

β-葡萄糖苷酶发酵技术的进展

β-葡萄糖苷酶能作用于纤维二糖或纤维寡糖,使其水解为葡萄糖,在木质纤维素降解等领域具有重要的应用价值。文章对β-葡萄糖苷酶及其菌种的筛选和诱变、发酵工艺的优化以及菌体生长过程和发酵控制等进行综述。     

腈水合酶/酰胺酶体系制备蛋氨酸羟基类似物

西洼湖戈登氏菌CGMCC 4.218 4含有一个高效的腈水合酶/酰胺酶体系。本文利用该菌株全细胞中的腈水合酶(Nitrile hydratas)催化2-羟基-4-甲硫基丁腈(HMTBN)水合为2-羟基-4-甲硫基丁酰胺(HMTBAm),利用酰胺酶(Amidase)以原位串联的方式将2-羟基-4-甲硫基丁酰胺水解为2-羟基-4-甲硫基丁酸(HMTBA,蛋氨酸羟基类似物)。考察了底物浓度、细胞质量浓度、温度、pH、反应时间对腈水合酶和酰胺酶活性的影响,对腈水合酶、酰胺酶的热稳定性和pH稳定性进行了测定。结果表明,最优的反应条件为:50 mmol/L HMTBN,3 g/L干重细胞,温度30℃,pH=8.0,反应时间30 min。在最优反应条件下,采用分批补料策略,细胞可使用23批次,HMTBA的累积量在44 h内达到164 g/L,其产率为95%。     

嗜热β-葡萄糖苷酶的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化嗜热β-葡萄糖苷酶,并检测其活性。方法从嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans基因组DNA中PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因,插入原核表达载体p ET-28a中,构建重组表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)Codon Plus,筛选阳性重组菌,IPTG诱导表达。采用镍柱亲和层析法纯化重组酶;紫外吸收法检测酶活力和底物选择性。结果 PCR退火温度为67℃时,可扩增得到单一的目的基因条带;测序结果显示,重组表达质粒中目的基因的核苷酸序列与细菌基因组中该基因序列同源性为100%,未发现终止密码子及氨基酸的改变;表达的重组酶相对分子质量约为54 000;纯化的目的蛋白纯度达95%,浓度为10 mg/L;该重组酶能够高效催化对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p NPG)的水解,60℃条件下的比活力达124 293.5 U/mg。结论成功在E.coli中表达了嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans来源的具有较高催化活力和底物专一性的β-葡萄糖苷酶。