双亚型(H3/H1)流感病毒血凝素基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建双亚型(H3/H1)流感病毒血凝素(HA)基因真核表达质粒,并在HeLa细胞中进行表达。方法通过PCR分别改造流感病毒H1亚型HA1和H3亚型HA基因片段,在融合片段间引入(G4S)3柔性linker和口蹄疫病毒2A蛋白linker。采用DNAstar结合生物信息学软件InsightⅡ分析后,对其空间构象进行模拟。将H1HA1-H3HA融合基因片段克隆至真核表达载体pVAX1 CMV启动子下游。通过脂质体法转染HeLa细胞,RT-PCR法检测转染细胞中目的基因mRNA的转录,间接免疫荧光检测转染细胞中目的蛋白的表达。结果表达双亚型(H3/H1)流感病毒血凝素基因的重组真核表达质粒pVAX1-H3HA-H1HA1经酶切和测序证明构建正确。转染重组质粒的HeLa细胞可检测到目的基因mRNA的转录和目的蛋白的表达。结论已成功构建了真核表达质粒pVAX1-H3HA-H1HA1,并可在HeLa细胞中正确转录与表达,为H3、H1亚型流感病毒双价核酸疫苗的研究奠定了基础。     

稳定表达丙型肝炎病毒HLA-A2限制性多表位基因C1R-AAD细胞克隆的建立

目的建立稳定表达丙型肝炎病毒(HCV)HLA-A2限制性多表位基因的C1R-AAD细胞克隆。方法合成人泛素基因(Ub)和HCVHLA-A2限制性多表位基因(Mep),分别克隆入原核表达质粒pRSET-A,构建多表位抗原基因的原核表达质粒pRSET-Ub-Mep。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切质粒pRSET-Ub-Mep,得到复合多表位基因Ub-Mep,亚克隆入真核表达载体pcD-NA3.1(-),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ub-Mep,转染至C1R-AAD细胞,G418压力筛选后,通过有限稀释法获得稳定表达Ub-Mep融合蛋白的C1R-AAD细胞克隆,采用RT-PCR法检测稳定转染细胞中Ub-Mep基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Westernblot法检测Ub-Mep蛋白在稳定转染细胞中的表达。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Ub-Mep经酶切鉴定证明构建正确;在稳定转染的C1R-AAD细胞中可检测到Ub-MepmRNA和蛋白水平的表达。结论已建立了稳定表达HCVHLA-A2限制性多表位抗原的C1R-AAD细胞克隆,为进一步研究HLA-A2限制性多表位基因诱导的细胞免疫应答建立了靶细胞。     

口蹄疫病毒复合多表位DNA疫苗的设计及构建

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT及其DNA疫苗。方法以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asia1型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,非结构蛋白3ABC上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白VP4上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建表达盒。将构建好的表达盒OAAT克隆到真核表达载体pVAX1 PCMV启动子下游,构建三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT,并用Western blot和IFA方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。结果通过InsightⅡ软件同源建模和DNAStar5.0软件分析表明,所构建的FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT理论上符合设计要求,且在真核细胞获得了正确表达。结论已成功设计FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,并构建了三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT。     

HIV-1表面糖蛋白gp120 DNA疫苗质粒的构建与表达

目的 构建含HIV-1表面糖蛋白基因的真核表达质粒,并在Hela细胞内表达。方法 在核酸疫苗载体质粒 pVAX1中插入gp120基因,构建真核表达质粒pVAXGP。在体外用脂质体法将重组质粒转染Hela细胞,并用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验和Dot-ELISA对表达产物进行检测。结果 间接免疫荧光试验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹试验和Dot-ELISA结果均显示,重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gp120蛋白。结论 已成功地构建了真核表达质粒,且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。     

WT1蛋白CTL表位肽基因载体的构建与鉴定

目的构建WT1(Wilms’tumor gene 1)蛋白CTL表位肽基因载体,并检测其在293T细胞中的转录。方法设计分别含WT1-126肽、WT1-235肽以及这两种肽的基因载体,并加入Th通用表位Pan-DR-Th(PADRE),应用蛋白酶体切割软件PAProC和NetChop优化各表位和间隔序列,DNA疫苗在线预测工具DyNAVacS优化真核密码子后,人工合成核苷酸序列,分别插入pUC57载体,构建pUC57-WT1质粒,测序鉴定后,酶切回收各目的片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒,转染293T细胞,RT-PCR检测各目的基因在293T细胞中的转录。采用无内毒素质粒大量提取试剂盒提取各重组质粒,采用紫外分光光度计测定质粒的纯度和浓度。结果各重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证实构建正确;重组质粒携带的目的基因可在293T细胞中成功转录;各重组质粒DNA的纯度均合格,浓度在864.6～883.9μg/ml之间。结论成功构建了WT1蛋白CTL表位肽基因载体,并能在真核细胞中正常转录,为下一步在小鼠体内探讨特异性不同的CTLs群发挥抗肿瘤作用的机制奠定了基础。     

DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达

目的利用塞姆利基森林病毒(SFV)复制子构建新型真核表达载体,并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下,连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中,构建新型真核表达载体pCS,再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中,构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞,进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示,重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24,并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达,且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性,为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。     

弓形虫P30蛋白抗原表位的克隆表达及纯化鉴定

目的构建表达P30蛋白抗原表位的重组质粒及工程菌,获得纯化的P30蛋白抗原表位,用于检测弓形虫特异性抗体。方法采用PCR技术,设计一对引物(P30P3、P30P4),从弓形虫基因组DNA中扩增出编码P30蛋白抗原表位的基因片段,与载体pET28a(+)连接,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDSPAGE分析。用离子交换纯化表达的P30抗原表位,用ELISA鉴定其抗原性。结果表达的P30蛋白抗原表位以包涵体形式存在,纯化的P30蛋白抗原表位片段有较好的抗原性,可用于检测弓形虫抗体。结论已成功构建了高表达P30蛋白的工程菌,为研制弓形虫抗体检测试剂或疫苗奠定了基础。     

幽门螺旋杆菌尿素酶多表位疫苗CTB-UE的生物信息学分析及其表达

目的通过生物信息学软件评价幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶多表位疫苗CTB-UE的抗原结构,并在E.coli中表达、纯化融合蛋白CTB-UE。方法应用生物信息学软件DNAstar、Geno3D、MOE分析Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE的二级结构和三级结构;将人工合成的尿素酶多表位肽基因UE插入含CTB基因的重组质粒p ETC中,构建重组表达质粒p ETCUE,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化重组蛋白CTB-UE,并进行Western blot分析。结果生物信息学软件分析显示,Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE具有合理的结构;重组表达质粒p ETCUE经双酶切和测序鉴定证实,融合基因CTB-UE与设计序列完全一致;表达的融合蛋白CTB-UE相对分子质量约为33 000,主要以包涵体形式表达,表达量占全菌蛋白的22.3%;纯化的融合蛋白CTB-UE纯度达95.6%,可与兔抗Hp多克隆抗体发生特异性结合。结论设计的Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE具有合理的结构,能在E.coli中高效表达,纯化后纯度较高,且具有较强的反应原性,为进一步研究针对尿素酶A、B双亚基的Hp多表位疫苗奠定了基础。     

HIV多表位核酸疫苗构建及其免疫原性

目的设计新型HIV复合多表位疫苗,并检测其在小鼠体内的免疫效果。方法检索抗原表位数据库,进行新型HIV多表位核酸疫苗的设计,利用化学合成的方法合成多表位基因,并构建重组质粒pVAX1-MEGNp24,转染BHK-21细胞,间接免疫荧光法检测多表位基因的表达。重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体动态变化,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类。结果重组质粒pVAX1-MEGNp24经酶切及测序分析,证明构建正确。间接免疫荧光显示能在BHK-21细胞中表达多表位基因。免疫小鼠可诱导小鼠特异性体液免疫和细胞免疫。结论已成功构建了重组质粒pVAX1-MEGNp24,小鼠免疫试验显示其具有良好的免疫原性。     

丙型肝炎病毒中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因重组真核表达质粒的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)S抗原嵌合基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行表达。方法从含HBV全序列的质粒pHBV中扩增HBV S抗原基因,在HBV S疏水区127和128位氨基酸序列处引入AgeⅠ酶切位点,将HCV E1和E2区保守的线性中和抗原表位及HVR1的模拟表位基因分别插入该位点,获得嵌合HCV中和抗原表位的重组HBV S基因,将该基因克隆至真核表达载体pCI-neo中,构建重组真核表达质粒pCI-HBSE1～4。将4种重组真核表达质粒转染293T细胞,间接免疫荧光和Western blot检测嵌合基因的表达。结果 4种重组真核表达质粒经双酶切证实构建正确;4种重组质粒转染的293T细胞胞浆内可见较强的绿色荧光,Western blot显示,在相对分子质量约27 000处可见蛋白条带。结论成功构建了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合基因真核表达质粒,其在293T细胞中可有效表达,为进一步制备嵌合HCV中和抗原表位的HBV S抗原VLP,研究中和抗体对HCV假病毒颗粒(HCVpp)和JFH-1 HCV体外培养系统(HCVcc)感染的抑制作用奠定了实验基础。     

人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体的构建

目的构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白。方法合成人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位的串联基因,克隆入pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-28a-H3,经酶切鉴定和DNA序列分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行ELISA和Westernblot鉴定。结果重组载体pET-28a-H3酶切片段大小和DNA序列分析与预期结果一致。表达的目的蛋白相对分子质量约9400,与相应的多克隆抗体反应性良好。结论已成功构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体pET-28a-H3,并表达了目的蛋白,为制备单克隆和多克隆抗体奠定了基础。     

复合通用CD4~+T辅助细胞表位基因克隆载体的构建及测序

目的构建复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,并进行测序。方法由DNA work2.0软件设计并人工合成20条55个碱基的寡核苷酸序列,利用套叠PCR技术人工合成全基因序列,并克隆至pUC19载体,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,酶切鉴定并进行测序。结果经PCR扩增出645bp的目的DNA片段。酶切鉴定筛选出8个阳性克隆,经测序获得一个序列完全正确的克隆。结论已成功构建了复合通用CD4+T辅助细胞表位基因克隆载体,为研究表位疫苗和细菌多糖结合疫苗提供了新的载体表位。     

狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3区缺失转移表达载体的构建及表达

目的构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞系统中高效表达。方法将含狂犬病毒SRV9株糖蛋白(Rgp)cDNA的pGT载体,经双酶切后回收Rgp基因片段,与经双酶切的真核表达载体pIRES1neo连接,得到pIRES1Rgp,再经双酶切后回收2623bp片段,与E3缺失载体pBE3L连接,得到含狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体pBE3LCRgp,再转染MDCK细胞。结果pBE3LCRgp转染的MDCK细胞,经间接ELISA和间接免疫荧光法在其培养上清中均能检出Rgp的高效表达。结论已成功构建狂犬病毒糖蛋白基因-腺病毒E3缺失转移表达载体,并在MDCK细胞中高效表达。     

中国流行株HIV-1Gag与IFN-α2b重组质粒的构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 ＨＩＶ－ １Ｇａｇ与 ＩＦＮ－ α２ｂ共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以 核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ为表达载体,构建重组核酸疫苗质粒ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ、ｐＩＲＥＳ１－Ｇａｇ－ＩＦＮ,通过间接免疫荧光 试验、ＤｏｔＥＬＩＳＡ检测Ｃａｇ／ｈＩＬ－２／ｈＩＬ－６基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,进行淋巴细 胞转化试验、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞数量测定、细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）特异性杀伤作用检测及血清抗体检测。 结果构建的重组质粒转染ＢＨＫ细胞后可表达目的基因,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖,诱导特异性 ＣＴＬ反应,当和 ＩＦＮ－α２ｂ共表达时免疫效果更加显著。结论与 Ｇａｇ蛋白共表达的 ＩＦＮ－ａ２ｂ能够进一步提高细胞 免疫与体液免疫水平,构建的重组质粒为ＨＩＶ－１ＤＮＡ疫苗的研究奠定了一定实验基础。     

H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗表达质粒的构建及其免疫原性

目的构建H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗表达质粒,并观察其免疫原性。方法分析H5N1人禽流感病毒HA基因的进化关系,人工合成人禽流感病毒HA基因(包含多数H5N1人禽流感病毒共有序列),构建含细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)和HA融合基因的真核表达质粒pVAX-CLHA及HA基因的真核表达质粒pVAX-HA,经酶切及测序鉴定正确后,转染293-T细胞,经RT-PCR法检测转染细胞中HA基因mRNA的转录水平,间接免疫荧光法(IFA)检测其表达;分别以质粒pVAX-CLHA及pVAX-HA免疫BALB/c小鼠,测定血清HI抗体效价。结果重组DNA疫苗表达质粒pVAX-CLHA和pVAX-HA经酶切及测序证明构建正确,转染的293-T细胞可检测到目的基因的转录及蛋白的表达;3次免疫后均能诱导BALB/c小鼠产生HI抗体,pVAX-CLHA诱导的HI抗体高于pVAX-HA。结论已成功构建了含H5N1HA及CTLA4融合基因的DNA疫苗表达质粒,其对小鼠具有良好的免疫效果,为H5N1高致病性人禽流感DNA疫苗的开发奠定了基础。     

H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒的构建及鉴定

目的构建H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,并进行鉴定。方法 PCR扩增H1N1亚型流感病毒(A/PR/8/34)全长M1基因,与pFastBacdua(lpFBD)载体连接,构建重组杆状病毒转移载体pFBD-M1,转化含有Bacimd和Helper质粒的DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-M1,将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测M1基因的插入,间接免疫荧光、Western blot和ELISA法检测M1蛋白的表达。结果重组杆状病毒骨架质粒rBacmid-M1经PCR鉴定证实构建正确;第3代rBac-M1病毒滴度为3×108pfu/ml;感染rBac-M1的sf9细胞经PCR扩增可见3 300 bp的条带,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可与鼠抗流感病毒(PR8)和鼠抗M1蛋白(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,ELISA检测M1蛋白可与鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。结论已成功构建了H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,为进一步研究流感病毒M1的功能及新型流感疫苗开发奠定了基础。