LHRH-PE40对宫颈癌细胞株细胞周期及Ki-67、Bcl-2的影响

目的观察LHRH-PE40对宫颈癌Hela细胞系凋亡及增殖的影响,为其临床应用提供理论依据。方法采用人宫颈癌Hela细胞株进行培养,在培养液中分别加入不同浓度的LHRH-PE40,作用48h后,观察Hela细胞形态的变化,并通过结晶紫染色法检测宫颈癌Hela细胞株对LHRH-PE40的感受性;用流式细胞仪及免疫组化法检测LHRH-PE40对Hela细胞周期、Ki-67及Bcl-2的影响。结果LHRH-PE40对Hela细胞活性的抑制作用呈剂量依赖性,通过量效曲线可以看出,LHRH-PE40的最小有效剂量为0·625μg/ml;半数致死剂量为0·969μg/ml。在1·0μg/ml浓度下,癌细胞中的Ki-67阳性细胞(用药前80%,用药后42%)及Bcl-2阳性细胞(用药前66%,用药后43%)比率均下降,凋亡细胞比率增加(由0增加到3·7%)。在1·0μg/ml浓度下,细胞的G0/G1期细胞比率增加15·21%;S期细胞变化不大,而G2/M期减少38·28%。结论LHRH-PE40可以有效地抑制宫颈癌细胞的增殖,诱发肿瘤细胞凋亡,是一种很有应用前景的抗肿瘤药物。     

流行性乙型脑炎病毒在二倍体细胞上的适应性

目的研究流行性乙型脑炎病毒在二倍体(2BS)细胞上的传代适应性,确定在2BS细胞上培养乙脑病毒的条件和方法。方法通过病毒毒力和免疫原性检测,观察在不同培养条件下乙脑病毒在2BS细胞上的增殖情况。结果pH值在7·4～7·6之间、人血白蛋白含量为0·2%、病毒稀释度为1:1000时,病毒维持液培养的病毒滴度最高。在2BS细胞上传50代的病毒滴度均在7·0logLD50以上,且差异无显著意义。连续传代后病毒的免疫原性下降。结论建议用于建立病毒种子库的流行性乙型脑炎病毒,在2BS细胞上传代不应超过3代。     

生物反应器培养Vero细胞和H1N1流感病毒

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞流感H1N1全病毒灭活疫苗的新工艺。方法利用Vero细胞作为流感病毒增殖的细胞基质,分别以无血清培养液Pro VERO和含血清DMEM培养液,利用5 g/L微载体cytodex-1在3 L硅化生物反应器中进行培养,培养温度(37±0.5)℃,溶解氧(50±20)%,p H 7.2±0.2,搅拌速度(50±20)r/min,待细胞在微载体上长成单层后,以0.1 MOI接种流感病毒Vero细胞高产适应株H1N1/JD/Va,将收获的病毒液经Sepharose 4FF和Capto Q两级纯化,灭活后制备疫苗原液及成品,按照《中国药典》三部(2015版)方法对其进行检定。结果使用无血清细胞培养液培养Vero细胞24 h贴壁率约83%,含血清细胞培养液培养24 h贴壁率为112%;灌流培养方式培养至第6天时,细胞均长至单层,无血清细胞培养液最终细胞数达到(133.4±2.0)×10~4个/m L,含血清细胞培养液最终细胞数达到(353.4±5.9)×10~4个/m L。无血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为388,单位细胞产毒比例为2.9;含血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为891,单位细胞产毒比例为2.5。用含血清细胞培养液培养Vero细胞接种病毒,收获病毒液制备的疫苗原液及成品经检测,各项指标均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立了3 L生物反应器含血清细胞培养液培养Vero细胞和H1N1流感病毒的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位特异性抗体检测方法的建立与评价

目的建立并评价幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)特异性抗体的检测方法。方法应用纯化的重组HpUreB作为包被抗原,建立检测HpUreB特异性抗体的ELISA间接法。以Hp抗体Western blot检测作为“金标准”,评价所建立方法的真实性和可靠性。结果检测血清特异性IgG的灵敏度为100·0%,特异度为97·7%,阳性预测值为97·2%,阴性预测值为100·0%,约登指数为0·977,符合率为98·7%,试验的一致率为98·5%;检测血清中总的特异性Ig灵敏度为97·1%,特异度为95·3%,阳性预测值为94·4%,阴性预测值为97·6%,约登指数为0·925,符合率为96·2%,试验的一致率为97·8%;检测唾液中特异性sIgA的灵敏度为96·2%,特异度为94·5%,阳性预测值为89·3%,阴性预测值为98·1%,约登指数为0·907,符合率为95·1%,试验的一致率为97·5%;检测粪便标本中的特异性sIgA的灵敏度为92·0%,特异度为90·2%,阳性预测值为85·2%,阴性预测值为94·9%,约登指数为0·822,符合率为90·9%,试验的一致率为98·6%,CV值均小于15%。结论该检测方法真实性、可靠性、重复性良好,能满足临床标本检测的要求。     

肝癌细胞上清液对成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白、环氧合酶-2和肝细胞生长因子的影响

目的观察小鼠肝癌细胞上清液对成纤维细胞增殖及表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的影响。方法制备小鼠成纤维细胞,并分别用普通培养液、小鼠肝癌细胞上清液的条件培养液及含转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的培养液培养成纤维细胞。采用MTT法检测3种培养液培养的成纤维细胞的增殖活力;RT-PCR和免疫组织化学法检测3种培养液培养的成纤维细胞中α-SMA、COX-2、HGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达情况。结果条件培养液及含TGF-β1的培养液对成纤维细胞的增殖均有促进作用,但条件培养液的促进作用更强。普通培养液培养的成纤维细胞在第5天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高,含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞在第3天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高,且明显高于普通培养液在第5天时的转录水平,第3天以后转录水平稳定;普通培养液培养的成纤维细胞中无COX-2和HGF转录;条件培养液及含TGF-β1的培养液培养的成纤维细胞在第5天时COX-2和HGF基因mRNA的转录水平最高,第5天后无明显下降。不同培养液培养的成纤维细胞中α-SMA蛋白在胞浆、胞膜均有不同程度的表达;普通培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白不表达,而含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白为阳性表达,表达部位均为胞浆。结论小鼠肝癌细胞上清液能有效、稳定地将成纤维细胞激活为稳定表达COX-2和HGF的肌成纤维细胞,其有望成为在细胞移植中促进移植细胞存活及血管重建的细胞。     

MTT法评价硫酸酯化魔芋多糖血液灌流吸附剂的体外细胞毒性

选用了L929小鼠成纤维细胞为靶细胞,用硫酸酯化魔芋多糖血液灌流吸附剂不同浓度的浸渍液,通过体外细胞培养法进行细胞毒性检测,于1 d、3 d、5 d测其吸光度(OD)值,计算细胞的相对增殖率,用6级毒性分类法评价。培养期各组细胞大量增殖,毒性级为0~1级,各实验组与阴性对照组比较无显著性差异(P>0 05);与阳性组比较有显著性差异(P<0 05)。说明硫酸酯化魔芋葡甘聚糖血液灌流吸附剂是一种具有良好细胞生物相容性材料。     

靶向高迁移率族蛋白A1基因RNA干扰真核表达载体的构建

目的构建针对人高迁移率族蛋白A1(HMGA1)基因的RNA干扰真核表达载体,为研究HMGA1基因在肿瘤细胞中的作用奠定实验基础。方法设计合成特异性针对人HMGA1基因的寡核苷酸序列,梯度退火后,与pU6mRFP载体连接,构建重组载体,转染人肝癌细胞SMMC-7721。通过激光共聚焦显微镜观察红色荧光,估测转染效率,RT-PCR法检测转染细胞HMGA1mRNA水平,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果DNA测序证实,成功构建了特异性HMGA1siRNA真核表达载体,转染后72h,转染效率为40%左右。所构建的载体能够特异性沉默转染细胞HMGA1基因的表达。转染细胞HMGA1基因沉默后,细胞凋亡率(27·86%±2·44%)明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为2·82%±2·39%和2·04%±0·70%),G0-G1期细胞百分数(77·73%±1·78%)明显高于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为42·19%±3·28%和39·23%±3·63%),G2-S期细胞百分数(22·27%±1·78%)明显低于空载体对照组和SMMC-7721对照组(分别为57·81%±3·28%和60·77%±3·63%)。结论成功构建了HMGA1的RNA干扰真核表达载体。     

shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞株P-gp表达的抑制作用

目的探讨靶向mdr1基因的shRNA表达载体对耐阿霉素的人红白血病细胞(K562/ADM)P-gp表达的抑制作用。方法合成靶向mdr1基因的短发夹shRNA表达载体,转染K562/ADM细胞。利用RT-PCR检测转染细胞中mdr1基因mRNA,Westernblot、免疫细胞化学和流式细胞术分别检测P-gp的表达。结果在瞬时转染pSilencerTM3·1-H1neomdr1-A和mdr1-BshRNA表达载体的K562/ADM细胞中,mdr1基因mRNA转录分别减少到39·1%(P<0·05)和30·8%(P<0·01)。Westernblot、免疫细胞化学和流式细胞术检测显示P-gp表达被明显而特异地抑制。结论靶向mdr1基因的shRNA表达载体能够特异而有效地抑制耐药的人红白血病细胞中的P-gp表达。     

干扰素脂质体的药代动力学和生物利用度

目的研究干扰素α2b脂质体药代动力学和生物利用度。方法采用旋转逆相蒸发法制备干扰素α2b脂质体。将小鼠分成2组,分别尾静脉注射干扰素α2b脂质体(L-IFN)和干扰素α2b(IFN),给药后分8个时间点采血,并取肝脏组织检测干扰素α2b含量。计算药代动力学参数和生物利用度。结果L-IFN组小鼠血液及肝脏组织中干扰素α2b消除速度低于IFN组,血中相对生物利用度为237·47%,肝脏中相对生物利用度为191·73%。结论干扰素α2b脂质体可明显提高小鼠的吸收和利用。     

LHRH-PE40对LOVO细胞的靶向杀伤作用

目的研究LHRH-PE40对LOVO细胞的靶向杀伤作用。方法用XTT检测LHRH-PE40对LOVO细胞的体外细胞毒性。将LOVO细胞移植于裸鼠,测定静脉注射LHRH-PE40对体内肿瘤细胞生长的抑制作用。结果LHRH-PE40对LOVO细胞细胞毒作用的半数抑制浓度为2·103μg/ml,在裸鼠肿瘤模型中,LHRH-PE40剂量为150μg/kg时抑瘤率为68·49%,这种细胞毒性作用可以被LHRH(或LHRH类似物)特异性抑制。结论在体内外LHRH-PE40对LOVO细胞具有很强的细胞毒作用,其机制是LHRH-PE40通过与癌细胞膜上的LHRH受体特异结合发挥细胞杀伤作用。     

轮状病毒在不同细胞上培养效果的比较

目的比较轮状病毒(rotavirus,RV)在不同细胞上的培养效果,确定RV最适培养细胞株。方法采用原代牛肾细胞(PCKC)、MA104细胞、CV-1细胞、Vero细胞4种细胞培养RV,观察RV在不同细胞培养过程中细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并检测病毒收获液的病毒毒力及病毒RNA。结果 MA104和PCKC细胞较适宜RV的增殖培养,其次是CV-1细胞,而Vero细胞感染病毒后3 d才出现CPE,6 d才有约75%的细胞圆缩死亡,这时收获的病毒液滴度也不及前3种细胞的病毒收获液滴度,且收获液的病毒RNA电泳的条带较模糊。结论 MA104、PCKC、CV-1细胞较适宜RV的增殖培养,而应用于大规模生产疫苗的Vero细胞培养RV要想达到前3种细胞的效果,还需进一步完善感染和培养方法。     

生物防晒剂活酵母细胞衍生物制备中酶解条件的优化

研究了紫外照射培养后蛋白酶添加量、酶解温度、酶解时间及pH等酵母菌酶解条件对酵母水解液的紫外吸收性能的影响,并将活酵母细胞衍生物应用于防晒护肤品中。实验结果表明,活酵母细胞衍生物的优化制备条件为:质量分数10%酵母菌液中添加2%的蛋白酶,1%的纤维素酶,pH=6,52℃酶解26 h。所制得的活酵母细胞衍生物作为防晒护肤品添加剂,使其SPF值最大可提高128.2%。     

一次性使用输液类产品所用不同材质细胞毒性试验方法的比较

目的:比较三种常用的细胞毒性的检测方法。方法:以L-929细胞为观察对象,对不同厂家的一次性使用输液类4种原料的浸提液进行细胞毒性研究,比较不同材料浸提液对细胞增殖度的影响,分析比较MTT法、XTT法和显微观察法三种不同测定方法的差异。结果:通过三种测定方法试验研究,不同厂家4种原料表现出对L-929细胞不同的细胞毒性,均呈现较高的细胞增殖度,无细胞毒性。结论:与显微观察法相比,MTT法和XTT法由于实际检测所需的细胞量相对较少、试验步骤相对简便、检测周期短,因此具有一定的优越性,值得推荐作为细胞毒性检测方法;XTT试剂盒成本较高,但其灵敏度更高,操作更简单。     

血管内皮生长因子抑制剂生物学活性检测方法的建立

目的建立血管内皮生长因子抑制剂(VEGF Trap)生物学活性检测方法。方法利用HEK293/D9/Flt-18R(al-pha)/Flt-IL18R(beta),clone V3H9细胞系,通过荧光素酶检测系统(Steady-Glo~ Luciferase Assaysystem)进行VEGF Trap的生物学活性检测,用VEGF Trap参考品计算供试品的相对百分效价,并对该方法进行精密性和准确性验证。结果VEGF Trap供试品及参考品在该方法中均存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D。3批VEGF Trap原液和6批成品经3次测定,相对百分效价的平均值在(90.00±2.40)%～(116.77±16.50)%之间,变异系数均小于15%。1批VEGF Trap原液及成品经3次测定,回收率分别为(90.40±2.67)%和(117.20±18.12)%。结论已成功建立VEGF Trap生物学活性检测方法,该方法重复性好,准确性高,可作为VEGFTrap生物学活性的常规检测方法。     

红曲素衍生物的合成及体外抗癌活性研究

从红曲色素中合成了3个衍生物,对不同的人癌细胞(SH-SY5Y、HepG2、HT-29、BGC-823、AGS和MKN45)的细胞毒性进行了评价。红斑素衍生物O1在受试化合物中显示出最大的抗癌作用。与紫杉醇相比,红斑素衍生物O1对人胃癌细胞SH-SY5Y、BGC-823、AGS和MKN45的生长抑制作用更强,同时,其对正常人胃上皮细胞GES-1的细胞毒性小于紫杉醇。在新的天然抗癌试剂的开发中,红斑素衍生物O1可以作为前体化合物提供。     

Bcl-2、C-Raf及双靶点RNAi质粒对HCT-8细胞株增殖的抑制作用

目的研究Bcl-2、C-Raf及双靶点的RNA干扰质粒对人结肠癌HCT-8细胞株增殖的抑制作用。方法利用Ambion公司网上设计软件,分别以Bcl-2和C-Raf为靶标,设计合成63个核苷酸的双链RNA,构建质粒pSilencer3·1-H1/Bcl-2、pSilencer3·1-H1/C-Raf及pSilencer3·1-H1/Bcl-2/C-Raf,分别转染结肠癌细胞株HCT-8,用MTT法检测其对细胞增殖的抑制作用,RT-PCR检测Bcl-2和C-Raf的mRNA转录。结果经MTT法检测,构建的Bcl-2和C-Raf基因及双靶点RNAi质粒3个转染组的细胞存活率均降低,双靶点质粒转染组较两个单靶点转染组细胞存活率明显降低,差异有显著意义。经RT-PCR检测,转染双靶点质粒后,HCT-8细胞中Bcl-2和C-Raf基因的表达均较对照组明显减弱。结论Bcl-2、C-Raf及双靶点RNAi质粒对HCT-8细胞株增殖有抑制作用。     

抗-HCV多表位抗体在检测HCV抗原中的应用

目的应用丙型肝炎病毒多表位抗体,探索从血浆或血清样品中检测丙型肝炎病毒抗原(HCAg)的可能性,为献血员筛选及临床早期诊断提供检测方法。方法利用原核系统表达的丙型肝炎病毒(HCV)7个高度保守区基因的多表位复合抗原免疫动物,制备抗-HCV多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测血浆或血清中的HCAg,并与RT-PCR法进行比较。结果制备的抗-HCV多表位复合抗原多克隆抗体,在用ELISA法检测HCAg中表现出较高的特异性及灵敏性,Cutoff值为0·239,批内CV值为5·60%~6·65%,批间CV值为7·80%。与RT-PCR比较,相关系数为0·816,灵敏度为88·89%,特异度为96·30%,一致性为95·24%,调整一致性为90·82%,阳性预测值为80·00%,阴性预测值为98·11%。HCAg检出率与美国ORTHO公司HCV-C抗原检测试剂盒差异无显著意义(P=0·06)。结论用HCV多表位复合抗原制备的多克隆抗体,采用ELISA双抗体夹心法检测HCAg,具有灵敏、特异、快速的优点,有望开发成为HCAg诊断试剂盒。     

铈(Ⅳ)-吐温-40-间苯三酚化学发光体系的研究及其应用

基于在吐温 4 0存在下 ,间苯三酚与铈 (Ⅳ )在酸性介质中发生化学发光反应 ,建立了测定间苯三酚化学发光分析法 ,该法测定间苯三酚的线性范围为 5 0× 10 -8～ 5 0× 10 -5mol·L-1,检出限为 1 0×10 -8mol·L-1,相对标准偏差为 2 8% (5 0× 10 -6mol·L-1邻苯二酚 ,n =11)。该法应用于测定模拟水样的间苯三酚 ,结果令人满意。     

重组抗TNF-α单克隆抗体ADCC生物学活性检测方法的建立

目的建立抗TNF-α单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法以健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作为效应细胞,自主构建膜表面表达TNF-α(membrane-expressed form of TNF-α,m TNF-α)CHO细胞作为靶细胞,通过系列不同浓度的重组抗TNF-α单克隆抗体原研药(m Ab-O)和候选药(m Ab-S)进行ADCC检测,采用四参数拟合计算二者的半数抑制浓度(IC_(50))及m Ab-S的相对活性,并在优化实验条件的基础上进行专属性、精密度验证。结果重组抗TNF-α单克隆抗体的浓度与细胞毒性存在量效关系,符合四参数方程式,曲线在半对数坐标上呈典型S型,R20.99。方法经优化确定相同个体来源PBMC作为效应细胞,靶细胞数目4×10~4个/孔,效靶比25∶1,抗体靶细胞孵育时间1 h,诱导时间4 h。该方法具有良好的专属性,对于相同个体来源的PBMC,m Ab-S活性总体与m Ab-O相近(50%~200%),相对活性重复性RSD为4.64%,同一实验人员间隔3个工作日检测结果的RSD为12.50%,2名实验人员2次检测结果的RSD为8.21%,均符合方法验证的可接受标准。结论成功建立了重组抗TNF-α单克隆抗体ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强,精密度好,可作为重组抗TNF-α单克隆抗体与上市原研药相对ADCC生物学活性的评估方法。     

bcl-2基因过表达的中国仓鼠卵巢细胞株的建立

目的建立bcl-2基因过表达的中国仓鼠卵巢细胞株。方法从CHO细胞中提取总RNA,以其为模板,采用RT-PCR方法扩增bcl-2基因,克隆入pcDNA3.1载体中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-bcl-2。利用脂质体转染法转染CHO-dhfr-细胞,用硫酸新霉素筛选阳性克隆,命名为CHO-G6细胞。通过流式细胞术检测bcl-2基因的表达及细胞凋亡水平,MTT法检测细胞的增殖活力。结果CHO-G6细胞bcl-2基因表达阳性率(92.46%)明显高于CHO-dhfr-细胞(76.08%);CHO-G6细胞的凋亡率(1%)明显低于CHO-dhfr-细胞(19%);在无血清培养基中培养1～5d,CHO-G6细胞的增殖活力均明显高于CHO-dhfr-细胞。结论已成功构建了表达bcl-2基因并具有一定抗凋亡能力的重组CHO细胞株,为进一步应用该细胞株生产重组蛋白奠定了基础。