重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性检测方法的建立及验证

目的建立重组人源化抗CD52单克隆抗体相对抗原结合活性的检测方法,并进行验证。方法测定3种人淋巴瘤细胞(MC/CAR、HUT78、RAMOS)CD52抗原的表达率,选择CD52表达率最高的作为靶细胞。以系列稀释的重组人源化抗CD52单克隆抗体的参比品和供试品作用表达CD52抗原的人淋巴瘤细胞,FITC标记的兔抗人Ig G结合人淋巴瘤细胞上的重组人源化抗CD52单克隆抗体,流式细胞分析仪测定几何荧光均数。通过四参数方程拟合,计算参比品和供试品的半数有效浓度(EC50)及相对结合活性。并对该方法的专属性、准确性、精密性、线性范围和耐用性进行验证。结果淋巴瘤MC/CAR细胞CD52抗原表达率最高,确定该细胞为靶细胞。CD52抗原与无关抗体不存在特异性结合;重复3次测定不同理论相对结合活性人源化抗CD52单克隆抗体参比品的回收率在97.4%~111.9%之间,相对结合活性及回收率的RSD值均在10%以内;同一实验人员于同一天6次重复检测重组人源化抗CD52单克隆抗体相对结合活性在86.93%~114.42%之间,RSD值在10%以内,3 d内不同实验员分别检测5个效价样品的相对结合活性的RSD在20%以内;在重组人源化抗CD52单克隆抗体理论效价50%~150%范围内,与相对结合活性呈良好的线性,线性回归方程为y=1.045 2 x-1.082,R2为0.992 1;MC/CAR细胞在第28代时仍适用于抗CD52抗体相对结合活性的测定。结论该方法具有良好的特异性、准确性、精密性、线性和耐用性,且操作简便,可用于重组抗CD52抗体抗原结合活性的常规检测。     

重组抗TNF-α单克隆抗体ADCC生物学活性检测方法的建立

目的建立抗TNF-α单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法以健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作为效应细胞,自主构建膜表面表达TNF-α(membrane-expressed form of TNF-α,m TNF-α)CHO细胞作为靶细胞,通过系列不同浓度的重组抗TNF-α单克隆抗体原研药(m Ab-O)和候选药(m Ab-S)进行ADCC检测,采用四参数拟合计算二者的半数抑制浓度(IC_(50))及m Ab-S的相对活性,并在优化实验条件的基础上进行专属性、精密度验证。结果重组抗TNF-α单克隆抗体的浓度与细胞毒性存在量效关系,符合四参数方程式,曲线在半对数坐标上呈典型S型,R20.99。方法经优化确定相同个体来源PBMC作为效应细胞,靶细胞数目4×10~4个/孔,效靶比25∶1,抗体靶细胞孵育时间1 h,诱导时间4 h。该方法具有良好的专属性,对于相同个体来源的PBMC,m Ab-S活性总体与m Ab-O相近(50%~200%),相对活性重复性RSD为4.64%,同一实验人员间隔3个工作日检测结果的RSD为12.50%,2名实验人员2次检测结果的RSD为8.21%,均符合方法验证的可接受标准。结论成功建立了重组抗TNF-α单克隆抗体ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强,精密度好,可作为重组抗TNF-α单克隆抗体与上市原研药相对ADCC生物学活性的评估方法。     

重组人源化抗DR5单克隆抗体质控方法的建立

目的建立重组人源化抗DR5单克隆抗体的质控方法。方法利用Colo205细胞杀伤试验测定重组人源化抗DR5单克隆抗体的生物学活性;SDS毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)和分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SE-HPLC)分析纯度;成像毛细管等点聚焦电泳(imaged capillary isoElectric focusing,iCIEF)法测定等电点及电荷异质性;毛细管区带电泳(capillary zone dlectrophoresis,CZE)和肽图法进行鉴别试验;切糖后对N-糖进行2-氨基苯甲酰胺(2-amino benzamide,2-AB)标记,采用亲水相互作用液相色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)柱分离并结合质谱对其糖型进行分析。结果重组人源化抗DR5单克隆抗体生物学活性的EC50值为(9.09±1.03)ng/ml,RSD为11.33%。非还原CE-SDS主峰面积为(90.35±0.19)%,RSD为0.21%;还原CE-SDS重链和轻链峰面积共为(96.37±0.20)%,RSD为0.21%;SE-HPLC主峰面积为(99.14±0.13)%,RSD为0.13%。iCIEF分析主峰等电点为(8.95±0.00),RSD为0.00%;CZE和肽图法可对制品做出鉴别。糖谱分析方法相对灵敏。结论建立了重组人源化抗DR5单克隆抗体的质控方法,该方法具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,为我国单克隆抗体的质量检测提供了参考依据。     

病毒灭活/去除工艺对抗CD20单克隆抗体生物学活性影响评价方法的建立

目的建立病毒灭活/去除工艺对抗CD20单克隆抗体生物学活性影响的评价方法。方法以Raji细胞株作为靶细胞,通过补体依赖性细胞毒(complement dependent cytotoxicity,CDC)作用,用CCK-8试剂进行抗CD20单克隆抗体的生物学活性检测,并验证系统适应性。以抗CD20单克隆抗体参比品计算低pH及纳米膜过滤(简称纳滤)2种病毒灭活/去除工艺前后样品的相对百分效价,并对检测结果进行统计学分析。结果抗CD20单克隆抗体CDC生物学活性存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)~B]+D。该方法的曲线平行性较好,且有良好的稳定性和有效性。低pH病毒灭活工艺处理前后样品的相对效价分别为(97. 22±2. 49)%和(87. 84±5. 60)%,相对变化值的平均平方值为10. 57%;纳滤病毒去除工艺处理前后样品的相对效价分别为(87. 65±4. 31)%和(89. 43±7. 33)%,相对变化值的平均平方值为4. 17%。2种工艺3次检测间差异的单因素方差分析及处理前后配对t检验差异均无统计学意义(P 0. 05)。结论以抗CD20单克隆抗体为目标抗体,建立了病毒灭活/去除工艺对生物学活性影响的评价方法,该方法具有良好的平行性、稳定性及有效性,为其他单克隆抗体类治疗药物的质量控制提供了实验依据。     

抗CD52单克隆抗体外源DNA残留量检测方法的建立及验证

目的建立检测抗CD52单克隆抗体原液中残余DNA的方法,并对该方法进行验证。方法利用CHO Host Cell DNA Extraction&Amplification Kit,采用qPCR法检测抗CD52单克隆抗体中宿主细胞残留DNA含量,并进行方法的专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证。结果该方法可以准确定量检测CHO细胞残留DNA含量。专属性验证试验中对照制剂无特异扩增曲线,而CHO细胞上清有明显的扩增曲线;5次试验中标准曲线相关系数R~2均≥0.98,表明该方法线性良好;准确度验证试验中所有试验的加标回收率均在70%~130%范围内;精密度验证试验中所有试验检测结果的相对标准偏差(RSD)均不大于30%;耐用性验证试验中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的CV为0.85%,不同稀释倍数的供试品加标回收率在70%~130%范围内,不同稀释倍数外源DNA检测结果CV为4.71%。结论该方法专属性、准确度、精密度、线性和耐用性均符合要求,可采用该试剂盒qPCR法检测外源DNA残留量。     

抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的优化及验证

目的优化抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体体外生物学活性的检测方法,并进行验证。方法对TNF-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法中的结晶紫染色液浓度、细胞浓度、放线菌素D(Act D)浓度及TNF-α杀伤浓度进行优化,并对该方法的精密度及专属性进行验证。绘制质量控制图,对抗TNF-α单克隆抗体样品进行20次重复检测。结果结晶紫染色液、细胞浓度、Act D和TNF-α的最适浓度分别为0.2%、1.5×105个/ml,1 ng/ml和0.8μg/ml。同一人员于不同日6次重复测定参考品的半数有效浓度(ED50)均值为(44.18±6.858)ng/ml,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为15.522%;不同日由3位不同人员重复测定参考品的ED50均值为(41.19±3.05)ng/ml,RSD值为7.40%;在TNF-α浓度一定的情况下,随着抗TNF-α单克隆抗体和阳性对照Humira浓度的降低,细胞的存活率随之降低,其他抗体无此现象。抗TNF-α单克隆抗体样品的20次测定结果均成立。结论成功优化了抗TNF-α单克隆抗体体外生物学活性检测方法的条件,该方法具有良好的精密度及专属性。     

抗CD20单克隆抗体质量控制中生物学活性的趋势分析

目的对抗CD20单克隆抗体质量控制中的生物学活性进行趋势分析。方法利用人淋巴瘤Raji细胞株作为靶细胞,通过补体依赖的细胞毒作用(complement dependent cytotoxicity,CDC),使用Cyto Tox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂监测抗CD20单抗的生物学活性,以抗CD20单抗参比品计算供试品的相对百分效价。通过对中国食品药品检定研究院(NIFDC)和企业质控实验室99批次抗CD20单抗生物学活性的检测结果,分别建立警戒限(均值±2 SD)和行动限(均值±3 SD),绘制趋势分析图,并对检测结果进行连续性及周期性趋势分析。结果对2009~2013年某企业抗CD20单抗的生物学活性测定结果显示,抗CD20单抗供试品和参比品在CDC活性中均存在量效关系,且符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D。NIFDC体外CDC活性的相对百分效价为(99.95±10.83)%,企业自检的相对百分效价为(100.71±9.29)%;对上述结果进行连续性趋势分析,未发现超出行动限的结果;对不同年度间数据进行方差分析显示,年度间差异无统计学意义(P0.05),数据具有可比性;对年度数据进行周期性趋势分析,结果均在行动限以内,无过高或过低结果,未出现严重的漂移或连续两批结果相差4 SD以上结果,总体趋势较平稳。结论首次通过对抗CD20单克隆抗体生物学活性的趋势分析,反映了该制品的批间一致性以及生产工艺的稳定性,也为其他单抗类治疗药物质量控制中关键质量属性的趋势分析提供了参考。     

重组人源化抗程序性死亡受体-1单克隆抗体关键质控方法的建立

目的建立重组人源化抗程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)单克隆抗体关键质量指标的质控方法。方法经胰蛋白酶切后采用反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)肽图法对3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体进行鉴别,同时采用还原/非还原型十二烷基磺酸钠毛细管凝胶电泳(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfonate,CE-SDS)法、分子排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法、毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing,cIEF)法、阳离子交换高效液相色谱(cation exchange high performance liquid chromatography,CEX-HPLC)法及混合淋巴细胞反应与竞争ELISA相结合的方法分别检测3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体的纯度、单体和聚体含量、等电点、不同电荷异构体的含量及生物学活性。结果 3批重组人源化抗PD-1单克隆抗体(批号为batch1、batch2、batch3)的肽图图谱与参考品一致;还原型CE-SDS的纯度分别为97.8%、98.1%和97.9%,非还原型CE-SDS纯度分别为95.7%、95.4%和95.5%;单体含量分别为99.3%、99.1%和99.4%,聚体含量为0.5%、0.6%和0.4%;主峰等电点均为7.4;酸性区含量分别为21.8%、21.4%和21.6%,主峰含量分别为58.4%、58.6%和58.7%,碱性区含量分别为19.8%、20.0%和19.7%;相对生物学活性分别为112%、98%和102%。结论本实验建立的重组人源化抗PD-1单克隆抗体关键质量指标的质控方法可用于该制品的常规质量控制。     

前蛋白转化酶枯草溶菌素9单克隆抗体抗原结合活性间接ELISA测定方法的建立

目的建立前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)单克隆抗体抗原结合活性的间接ELISA测定方法。方法利用链酶亲和素-生物素系统捕获包被PCSK9蛋白,采用间接ELISA法检测PCSK9单抗参比品和供试品,通过拟合四参数方程Y=(A-D)/[1+(X/C)~B]+D,得出两者的半数有效浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC_(50)),计算供试品的抗原结合活性。同时验证该方法的专属性和精密性。结果 PCSK9单抗参比品、供试品及Evolocumab(Amgen)的曲线均呈显著的剂量依赖关系,符合四参数方程,且R~20.99;抗CD115抗体及空白稀释液不存在类似的剂量效应曲线;重复性、人员及日间精密性的相对标准偏差(relative standard deviatin,RSD)分别为7.5%、11.3%和10.4%,均15%。结论成功建立了抗PCSK9单抗抗原结合活性的间接ELISA检测方法,该方法专属性和精密度良好,可用于PCSK9单抗抗原结合活性的常规测定。     

重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的重组人凝血因子Ⅷ产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用。方法采用磁珠分离法提取样品中残留的CHO细胞DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行Q-PCR检测,根据标准曲线进行DNA残留量分析。对建立的方法进行专属性、准确性、重复性及中间精密度验证,并对重组人凝血因子Ⅷ原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果该方法 DNA浓度在0.003~300 pg/μL范围内,线性关系良好,R2为0.999,灵敏度可达0.003 pg/μL;对大肠埃希菌DNA无特异性扩增曲线,专属性良好;检测高、中、低浓度DNA加标量样品的回收率分别为82.68%、71.75%和72.67%,准确性良好;重复性检测的RSD为7.02%,中间精密度检测的RSD为9.31%,重复性及精密度良好。用该方法检测的3批重组人凝血因子Ⅷ原液的DNA残留量均远低于100 pg/剂量。结论成功建立了特异的CHO细胞DNA残留量的检测方法,该方法专属性好,准确性及精密度高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。     

前蛋白转化酶枯草溶菌素9单克隆抗体生物学活性荧光染料标记法的建立、优化及验证

目的建立并优化前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)单克隆抗体生物学活性的荧光染料标记检测法,并进行验证。方法对建立的荧光染料标记法的细胞铺板密度(1×10~5、5×10~5和1×10~6个/mL)、PCSK9蛋白浓度(5、20、40、80μg/mL)、荧光标记的低密度脂蛋白(low density lipoprotein labeled with 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate,Dil-LDL)浓度(10、16、20μg/mL)、单克隆抗体的浓度梯度(200、52、20、12、8、4、0. 8μg/mL,200、30、10、6、4、1、0. 2μg/mL,200、28、9、6、4、2、0. 2μg/mL)进行优化,并对优化方法的专属性、准确度、精密度、线性范围、耐用性进行验证。结果最适方法检测条件:铺板密度为5×10~5个/mL,PCSK9蛋白和Dil-LDL浓度分别为20和16μg/mL,单克隆抗体的浓度梯度为200、52、20、12、8、4、0. 8μg/mL。该方法可特异性检测PCSK9单克隆抗体;供试品检测回收率在70%～130%之间;供试品检测结果的相对标准偏差(RSD)均10%;供试品效价在50%～150%之间时,检测值与理论值呈良好的线性关系,线性拟合方程为y=1. 002 x-0. 006 7,R~2=0. 997 8;耐用性检测活性均在70%～140%范围内。结论本实验建立的方法具有良好的专属性、准确度和精密度,可用于PCSK9单克隆抗体的生物学活性测定。     

测定重组肠道病毒71型疫苗(汉逊酵母)原液纯度的高效分子排阻色谱法的建立及方法的验证

目的建立检测重组肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)(汉逊酵母)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)纯度的高效分子排阻色谱法(SEC-HPLC),并进行验证。方法建立SEC-HPLC法检测EV71 VLP纯度,并对该方法的专属性、精密度、检测限、定量限、耐用性及拖尾因子等指标进行验证。结果空白溶剂在设定的积分范围内无特异峰出现。重复性试验中原液参比品保留时间和峰面积相对标准偏差(RSD)分别为0. 14%和0. 21%,3批分析原液保留时间RSD均<0. 3%,峰面积RSD均<0. 8%;中间精密度试验原液参比品和3批分析原液保留时间RSD均<0. 2%;峰面积RSD均<2. 0%。检测限为样品浓度2. 5μg/mL,进样体积20μL;定量限为样品浓度10μg/mL,进样体积20μL。耐用性试验中原液参比品在不同浓度流动相中连续进样3次,保留时间和峰面积RSD均<2. 0%。原液参比品和3批分析原液目的峰的拖尾因子为1. 210±0. 01,RSD为0. 90%。结论建立的SEC-HPLC方法专属性、精密度、耐用性良好,适用于EV71(汉逊酵母)VLP纯度的检测。     

人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体质控方法的建立

目的建立人源化抗表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体的质控方法。方法采用体外细胞生长抑制试验测定人源化抗EGFR单抗的生物学活性;质谱法和还原型SDS-PAGE法测定其准确相对分子质量;去封闭后用Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列;SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)法测定其纯度;反向液相色谱(RP-HPLC)法测定其肽图;定量PCR法和狭缝杂交法测定其外源性DNA残留量;其余项目按《中国药典》三部(2010版)要求进行。结果人源化抗EGFR单抗原液和成品的相对生物学活性分别为(100±20)%和(94±14)%;质谱法测得该单抗参考品轻、重链的相对分子质量分别为23 370.75和50 341.00,相对误差分别为0.005%和0.006%;还原型SDS-PAGE测得该单抗轻、重链的相对分子质量为27 000和53 400;轻、重链N-末端氨基酸序列均与理论一致;单抗原液的还原型SDS-PAGE纯度为98.5%;SEC-HPLC原液纯度为(98.39±0.05)%和成品SEC-HPLC纯度为(98.17±0.04)%;肽图图谱与理化参考品一致;定量PCR测得其外源DNA残留量小于100 pg/剂量;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求及其他相关要求。结论初步建立了人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体的质控方法,可用于该制品的常规质量控制。     

基于中和表位的GⅡ.4型重组诺如病毒VP1蛋白病毒样颗粒抗原含量检测方法的建立及验证

目的建立基于中和表位的GⅡ. 4型重组诺如病毒(Norovirus,NoV)VP1蛋白病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)抗原含量检测方法,并进行验证,以用于重组NoV疫苗质量控制。方法应用ELISA和HBGA-VLP阻断试验筛选中和性单克隆抗体,并筛选配对抗体,分别作为包被抗体和检测抗体,建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。确定方法的线性检测范围,并对方法的专属性、准确性和精密性进行验证。结果27株GⅡ. 4 VLP特异性ELISA检测阳性的杂交瘤细胞克隆中,有12株GⅡ. 4型阻断抗体检测呈阳性,选择具有GⅡ. 4型阻断活性的特异性单抗2H7-C5和2E6-B3作为双抗夹心抗体对,用于建立GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP双抗夹心ELISA抗原定量检测方法。该方法的线性测定范围为15. 63～250 ng/mL,标准曲线R2均 0. 98;准确性验证的加标回收率在72. 23%～134. 03%之间;重复性验证的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为7. 06%,中间精密性验证的RSD分别为8. 04%和9. 14%。结论建立了基于中和表位的GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP抗原含量检测方法,该方法专属性、准确性、精密性良好,可用于GⅡ. 4型重组NoV VP1蛋白VLP定量检测,为GⅡ. 4抗原相关疫苗研发中质量控制和检定提供了技术支持。     

毛细管电泳法测定重组人源化IgG2抗体的纯度

目的建立利用毛细管电泳法测定重组人源化免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)纯度的方法,并进行优化和验证。方法采用单因素法,对稀释液、碘乙酰胺浓度(非还原条件)、加热方式、进样电压、进样时间、分离电压、样品盘和卡盒温度进行多水平优化,并利用优化的方法测定IgG2的纯度。以峰面积对样品加样量进行线性回归,确定该方法的线性范围,并对该方法进行精密度、准确度及溶液稳定性验证。结果最佳电泳条件为:选用超纯水作为稀释液,250 mmol/L碘乙酰胺(非还原条件),70℃干热10 min,进样电压为5 kV,进样时间为30 s,分离电压为15 kV,样品盘和卡盒温度为20℃。在优化的色谱条件下,在还原条件下,IgG2纯度检测的线性范围为50~150μg,相关系数为0.998,重复性的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.14%,中间精密度的RSD为0.24%,且20℃放置13 h稳定;在非还原条件下,IgG2纯度检测的线性范围为50~150μg,相关系数为0.999,重复性的RSD为0.36%,中间精密度的RSD为0.16%,且20℃放置13 h稳定。结论该方法线性关系良好,且精密度、准确度、灵敏度较高,测定结果稳定可靠,适用于重组人源化IgG2的纯度分析。     

人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体在CHO K1细胞中的表达及鉴定

目的 CHO K1细胞中表达人源化抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体,并进行鉴定。方法采用电穿孔转染法将含编码人源化抗VEGF单克隆抗体轻、重链全基因的真核表达质粒DGV-K11转染至CHO K1细胞,经L-蛋氨酸亚砜(methionine sulfoxide,MSX)加压筛选和有限稀释克隆筛选,获得分泌表达人源化抗VEGF单克隆抗体的K11细胞株。利用生物反应器培养K11细胞,采用MabSelect SuRe、DEAE Sepharose FF和Eshmuno S凝胶色谱纯化培养液,以贝伐珠单抗(Bevacizumab)作为阳性对照,分析人源化抗VEGF单克隆抗体的纯度、电荷异质性、相对分子质量、N-末端序列、等电点及生物学活性。结果人源化抗VEGF单克隆抗体还原和非还原型CE-SDS分析图谱峰形及电荷异质性与阳性对照相似,轻、重链N-末端氨基酸序列一致;人源化抗VEGF单克隆抗体及阳性对照的SEC-HPLC单体纯度分别为97.46%和97.08%,完整相对分子质量分别为149 201.76和149 201.81,主峰等电点分别为7.31和7.32,生物学活性分别为0.993×10~4和0.960×10~4 U/mg。结论于CHO细胞中成功表达了人源化抗VEGF单克隆抗体,与贝伐珠单抗(Bevacizumab)具有相似的纯度、电荷异质性及生物学活性,本实验为CHO细胞大规模表达人源化抗VEGF单克隆抗体奠定了基础。     

全人源抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体毛细管等电聚焦鉴别方法的建立及验证

目的建立用于全人源抗人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体鉴别的毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,c IEF)方法,并进行验证。方法通过优化c IEF过程中各关键实验参数,如阴极稳定剂浓度、阳极稳定剂浓度、两性电解质浓度、3-10与8-10.5两性电解质比例、聚焦时间、聚焦电压,建立c IEF方法,并对方法的专属性、重复性、中间精密度进行验证。结果确定c IEF方法的实验参数为:阴极稳定剂浓度30 mmol/L,阳极稳定剂浓度3.2 mmol/L,3-10两性电解质在样品溶液中体积比为6.0%,聚焦电压为25 k V,聚焦时间为10 min。保护剂在样品出峰时间无紫外吸收峰,阳性对照阿达木单抗与样品出峰时间及峰形一致,阴性对照利妥昔单抗生物类似药、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗生物类似药、西妥昔单抗与样品出峰时间及峰形均不一致,且对样品无干扰;样品制备重复性主峰等电点的相对标准差(relative standard deviation,RSD)为0.114%,中间精密度RSD为0.837%。结论建立的c IEF方法 p H梯度和精密度良好,专属性较强,适用于制品的批放行鉴别试验。     

重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺的优化

目的优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺。方法采用试验设计(Design of Experiment,DOE)方法优化重组抗CD52单克隆抗体亲和层析纯化工艺,试验因子为中间清洗液Na Cl浓度(130~870 mmol/L)和洗脱液p H(3.50~4.20),试验响应变量为纯化后样品收率、纯度、残余宿主蛋白含量、外源DNA含量及蛋白A含量,通过DOE构建模型,预测中间清洗液Na Cl浓度和洗脱液p H范围。同时采用DOE方法验证预测工艺参数的稳定性。结果确定中间清洗液Na Cl浓度为400~700 mmol/L,洗脱液p H为3.55~3.75。试验因子在该参数范围内变动时,样品收率均大于80%,纯度均大于97%,外源DNA浓度均低于260 pg/mg,宿主蛋白含量均低于2 300 ng/mg,蛋白A含量均低于6.5 ng/mg。结论成功优化了重组抗CD52单克隆抗体的亲和纯化工艺,且具有较好的稳定性。     

重组蛋白中G418残留量超高效液相色谱-蒸发光散射检测方法的建立

目的建立定量检测重组蛋白中G418残留量的超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)-蒸发光散射检测(evaporative light scattering detection,ELSD)法,并进行验证。方法G418经UPLC洗脱后,通过蒸发光散射检测器检测,首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶,然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发,余下不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中进行检测,通过标准曲线计算质控品中G418浓度。对建立的方法进行专属性、重复性、中间精密度、定量限、耐用性、线性验证。结果G418浓度在0.01~0.20 mg/mL范围内,标准曲线的线性较好,R2>0.99,定量限为0.01 mg/mL;质控品的加样回收率在80%~120%之间;中间精密度试验回收率的RSD为3.44%;定量限试验回收率的RSD为5.38%;耐用性试验回收率的RSD为4.56%。结论UPLC-ELSD法精密度良好,可用于重组蛋白研发及生产过程中G418残留的监测。     

单克隆抗体消光系数测定方法的建立

目的建立单克隆抗体药物消光系数测定方法,用于单克隆抗体药物的鉴别和紫外分光光度法的定量分析,并对其进行初步评价。方法使用6 mol/L盐酸胍对抗体进行变性处理,打开抗体折叠的高级结构,将其当作是色氨酸、酪氨酸和"S-S"键的三元体系,通过检测相同浓度下折叠和非折叠抗体在紫外280 nm波长处的吸光值,计算抗体的消光系数,并进行方法的精密度验证。结果两种单克隆抗体m Ab1和m Ab2在280 nm波长处的消光系数平均值分别为1.702和1.387 m L/(mg·cm);两位实验员检测的消光系数各自相对标准偏差分别为0.48%和0.87%,总相对标准偏差为0.69%,均小于1%,表明方法精密度良好。结论建立的方法操作简单,不依赖于抗体浓度,不破坏其二硫键结构,结果准确,可用于单克隆抗体药物消光系数的测定。