影响多步脱氢酶CrtI功能的关键结构特征探索

在生物体内存在可催化多步连续反应的通用酶,对生物代谢过程具有重要作用。八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)作为典型代表,可以催化多步连续脱氢反应,生成番茄红素等具有重要价值的产物。本文以酿酒酵母为底盘研究CrtI的催化功能特征。首先通过组合设计与筛选番茄红素合成路径中的三种外源酶CrtE、CrtB和CrtI,发现CrtI是主要的限制因素,且三孢布拉氏霉菌来源的CrtI (BtCrtI)表现出优异的催化功能。通过生物信息学与蛋白结构分析发现BtCrtI的S311残基是连接和稳定活性中心结构的关键。随后通过分析该位点的饱和突变结果,揭示了该位点的氨基酸残基类型对活性中心结构和功能的显著作用,为酶的设计和改造提供了新的思路。同时发现CrtI的活性差异未对合成路径中的类胡萝卜素的代谢流造成扰动,表明CrtI是番茄红素的产量和纯度的决定因素。     

漆酶的结构与催化反应机理

漆酶是一种广泛分布的多酚氧化酶,主要由单一多肽、铜离子活性中心、糖配基组成。多肽链一般含有18种氨基酸,构成漆酶的结构主体;糖配基因漆酶的来源不同而异,是漆酶多样性的标志之一。漆酶活性中心的铜离子依据光学和磁学特性被分为3种类型:Ⅰ型或蓝型铜,Ⅱ型或通常型铜,Ⅲ型或偶联的双核型铜。漆酶的催化反应机理主要包括酶对底物的电子提取、电子的传递和氧分子对酶的还原三步,是一个通过电子转移发生氧化还原反应的过程。     

吡咯烷酮类螺环化合物与β-分泌酶活性中心的结合机制

旨在研究吡咯烷酮类螺环化合物抑制剂与β-分泌酶之间的作用机制。通过Autodock4.2软件将20个吡咯烷酮类螺环化合物为核心结构的BACE1抑制剂对接进BACE1的活性中心,分析其与受体BACE1间的结合机制。研究结果发现,活性中心Asp32、Tyr71、Gln73和Asp228残基对于将抑制剂小分子固定在活性中心的过程中起到非常重要的作用。β-分泌酶通过活性中心残基Gln73、Asp32、Asp228与抑制剂分子之间形成的氢键,以及通过TYR71上的苯环与抑制剂的苯环形成π-π堆积作用将抑制剂固定在酶的活性中心。     

黄粉虫纤溶酶的三维结构模拟与序列分析

为了深入研究黄粉虫纤溶酶的纤溶机理,用生物信息学方法对黄粉虫纤溶酶进行了三维结构模拟与序列分析。首先找到了其活性中心,利用Biosun软件的同源模建技术,模拟了黄粉虫纤溶酶的三维结构;利用Goldkey软件,对黄粉虫纤溶酶的氨基酸序列进行了分析,重点讨论了其等电点、亲水性、柔性与催化活性之间的关系,最后对纤维蛋白水解部位结构进行了分析。结果表明,黄粉虫纤溶酶的活性中心是组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸三个氨基酸残基,位于球蛋白中心凹穴处,底物结合部位是丝氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。从微观分子水平上阐述了该类酶水解纤维蛋白的机理是催化精氨酸-赖氨酸肽键水解,与报道的纤维蛋白的溶解机理相符。     

氢化酶的结构、催化机理及其应用

氢化酶既是生物制氢产业的研究热点,又是微生物代谢的关键酶。阐述了氢化酶的分类和特点,主要介绍了[Ni-Fe]和[Fe-Fe]氢化酶的活性中心结构、催化产氢机理以及氢化酶的利用价值。最后对氢化酶的研究进行了展望。     

新型温控离子液体绿色介质生物催化合成乙酸辛酯香料

设计合成3种新型1,3-二戊基咪唑六氟磷酸盐同分异构离子液体。以褶皱念珠菌脂肪酶Canadidarugosalipase酶催化合成乙酸辛酯为模型反应,分别考察介质对酶行为的影响。结果发现,酶在离子液体中的活性及反应性明显高于有机溶剂正己烷。基于[D(2-mb)Im][PF6]离子液体的温控特点,设计一种高温反应和低温分离相结合的乙酸辛酯合成路线。通过研究各种因素对1-辛醇转化率的影响,获得合成乙酸辛酯的最佳反应条件。在此最佳条件下,1-辛醇的转化率达99.3%,酶在[D(2-mb)Im][PF6]中的稳定性是正己烷中的8.3倍。此外,圆二色谱和内源荧光光谱被应用于不同介质中脂肪酶结构变化,结果表明酶在[D(2-mb)Im][PF6]中有较大的氨基酸残基裸露程度和良好的二级结构稳定性。     

甘草黄酮合酶Ⅱ催化甘草素特异性合成7，4′-二羟基黄酮

利用同源序列比对和分子进化树分析从胀果甘草转录组数据库中挖掘并成功克隆到2个黄酮合酶基因：Gur.gene26505和Gur.gene26116。经表征Gur.gene26505为黄酮合酶Ⅱ,具有催化甘草素特异性合成7,4′-二羟基黄酮的特性,而Gur.gene26116为黄烷酮2位羟化酶,可催化甘草素生成包括7,4′-二羟基黄酮在内的三种产物。进一步通过蛋白质结构预测、分子对接和分子动力学模拟探究了黄酮合酶Ⅱ(Gur.gene26505)催化合成7,4′-二羟基黄酮特异性的原因。由于Gur.gene26505活性口袋附近特有的刚性结构β片层使大位阻苯丙氨酸残基翻转至羟化中心下方,消除了羟化产物2-羟基甘草素进入脱水中心的阻力进而发生C₂-C₃位的脱水反应特异性生成7,4′-二羟基黄酮。最后通过基因过表达、反应条件优化和强化菌体生长建立了7,4′-二羟基黄酮特异性合成的最佳细胞催化工艺,使甘草素转化率达到了76.67%。     

甘草黄酮合酶Ⅱ催化甘草素特异性合成7，4′-二羟基黄酮

利用同源序列比对和分子进化树分析从胀果甘草转录组数据库中挖掘并成功克隆到2个黄酮合酶基因：Gur.gene26505和Gur.gene26116。经表征Gur.gene26505为黄酮合酶Ⅱ,具有催化甘草素特异性合成7,4′-二羟基黄酮的特性,而Gur.gene26116为黄烷酮2位羟化酶,可催化甘草素生成包括7,4′-二羟基黄酮在内的三种产物。进一步通过蛋白质结构预测、分子对接和分子动力学模拟探究了黄酮合酶Ⅱ(Gur.gene26505)催化合成7,4′-二羟基黄酮特异性的原因。由于Gur.gene26505活性口袋附近特有的刚性结构β片层使大位阻苯丙氨酸残基翻转至羟化中心下方,消除了羟化产物2-羟基甘草素进入脱水中心的阻力进而发生C₂-C₃位的脱水反应特异性生成7,4′-二羟基黄酮。最后通过基因过表达、反应条件优化和强化菌体生长建立了7,4′-二羟基黄酮特异性合成的最佳细胞催化工艺,使甘草素转化率达到了76.67%。     

生物酶催化芳香族化合物的羟化反应

在氧化还原反应中,单加氧酶有两种基本活性:将氧原子插入芳香族化合物中和完成电子从化合物到氧气的转移,为了降低反应中底物和辅酶不断消耗对酶活性的影响,反应中还需不断补充这两种物质。过氧化物酶和漆酶,它们也可以催化芳香族化合物的羟化反应,但是两者在与单加氧酶相比在酶活性部位金属种类、还原性辅酶种类、最终氧化产物以及每步反应电子传递数目上有所差别[1]。目前,学术界研究多拘于氧化还原酶、过氧化物酶和漆酶的单独研究,本文旨在现有研究上进行归纳总结,给出三种酶在催化羟化反应中的结构变化和作用机制。     

（R）-醇腈酶催化法合成（R）-（-）-1-（2-萘基）-2-N-甲基氨基乙醇

以2-萘甲醛为原料,经酶致转氰化、氰基还原、甲酰化、酰胺还原合成了光学活性(R)-(-)-1-(2-萘基)-2-N-甲基氨基乙醇5.转氰化过程采用来源于苦杏仁、枇杷仁、桃仁、黑布林果仁和苹果籽仁的醇腈酶催化HCN对底物醛的加成获得(R)-氰醇,通过比较反应产率和产物对映体过量值(ee)发现苦杏仁醇腈酶的催化效果最好,相应值分别为68.8%和88.3%;(R)-氰醇的O-保护衍生物2经化学法转化为标题化合物5,总产率达47%,ee值达88.0%, 其结构经IR和1H-NMR确证.实验结果表明,醇腈酶催化合成的手性氰醇光学纯度较高,是合成手性氨基醇化合物的优秀原料,并且在随后的化学转化过程中各步反应产物均很好地保留了光学纯度.     

酿酒酵母高效合成萜类化合物的组合调控策略

萜类化合物具有广泛的生理活性与重要的经济价值,利用酿酒酵母进行萜类合成具有低价、高效等优势。然而部分植物源合成萜类的关键酶在酿酒酵母中难表达、产量低,难以工业应用,因此有效的调控策略显得至关重要。本文从萜类化合物在酿酒酵母中的合成途径入手,介绍了关键酶、代谢途径、CRISPR基因编辑系统和人工合成染色体技术4个方面的调控策略在酿酒酵母合成萜类化合物中的应用。阐述了关键酶的筛选、改造,理性与非理性设计,MVA途径、乙酰辅酶A合成途径与亚细胞结构的代谢途径改造的优势。指出了多重调控策略组合调控的方式是实现酿酒酵母高效合成萜类化合物的有效方法。此外,CRISPR基因编辑系统与人工合成染色体技术的快速发展将为酿酒酵母细胞工厂的深入开发与利用提供有力工具。     

Second Coordination Sphere Effects on the Mechanistic Pathways for Dioxygen Activation by a Ferritin: Involvement of a Tyr Radical and the Identification of a Cation Binding Site

Ferritins are ubiquitous diiron enzymes involved in iron(II) detoxification and oxidative stress responses and can act as metabolic iron stores. The overall reaction mechanisms of ferritin enzymes are still unclear, particularly concerning the role of the conserved, near catalytic center Tyr residue. Thus, we carried out a computational study of a ferritin using a large cluster model of well over 300 atoms including its first- and second-coordination sphere. The calculations reveal important insight into the structure and reactivity of ferritins. Specifically, the active site Tyr residue delivers a proton and electron in the catalytic cycle prior to iron(II) oxidation. In addition, the calculations highlight a likely cation binding site at Asp₆₅, which through long-range electrostatic interactions, influences the electronic configuration and charge distributions of the metal center. The results are consistent with experimental observations but reveal novel detail of early mechanistic steps that lead to an unusual mixed-valent iron(III)-iron(II) center.     

酶工程：从人工设计到人工智能

计算机在酶工程中的应用使得酶的序列空间探索度不断被扩大。随着不同分子力场参数的建立,涌现出诸多以计算分子能量为基础的算法,并被用于酶的催化活性、稳定性、底物特异性等的改造与筛选。伴随计算机硬件的提升与算法的优化,从头设计全新功能的人工酶取得成功并得以发展。近年来,人工智能在蛋白质结构预测上不断获得突破,同时也被应用到酶的设计中。介绍了分子力场基础和酶设计与筛选的算法,重点阐述了从头设计的方法和成功案例,以及机器学习设计酶的流程和最新的研究进展,展望了人工智能在酶工程领域的未来发展,为酶的改造与全新功能的生物催化剂的设计助力。     

酶的寡聚结构与催化稳定性

酶的结构与催化稳定性是生物催化与转化过程中的研究热点之一。与单体酶相比,寡聚酶在进化过程中亚基之间的聚合使其在结构和功能上具有一定的优越性,然而寡聚酶独特的四级结构导致其在制备和应用中存在诸多问题,如制备效率低、催化位点利用率低、催化稳定性差等,其中亚基解离导致的催化稳定性问题在很大程度上限制了其工业化应用。目前,介质工程、多亚基固定化、亚基界面工程和融合蛋白策略被应用于寡聚酶的催化稳定性改造,而寡聚酶至单体酶的改造策略则试图从根本上解决寡聚酶的制备和应用问题,具有较好的应用前景。本文介绍了酶的寡聚结构演替所产生的新功能,总结了寡聚酶在制备和应用中存在的问题,重点阐述了提高寡聚酶制备效率和催化稳定性的策略。     

木瓜蛋白酶还原半合成酶

以木瓜蛋白酶作为模板,用四种N基取代基不同的吡啶盐对其活性中心的Cys-25进行修饰,得到与天然木瓜蛋白酶具有不同催化能力的半合成酶。在循环剂的存在下,将四种半合成酶应用于苯甲醛的催化还原。探索了其最适pH值和温度,并根据催化结果的不同,结合修饰剂在木瓜蛋白酶活性中心的结合情况,讨论了修饰剂与木瓜蛋白酶催化活性中心的其他基团的相互作用力,对其催化能力的影响。     

电压扰动对EAD代谢通量中微生物与关键酶活性的影响

为探究电压扰动对EAD代谢通量中微生物与关键酶活性的影响,实验采用单室EAD反应器,以电解电压为扰动变量,利用CNA构建代谢模型,对扰动前后微生物群落、酶活水平及通量变化进行讨论。结果表明,电压扰动后,产甲烷途径偏向于氢营养型产甲烷,约占38.5%,且0.6 V扰动时表现出最佳的甲烷通量,为0.5222 g。EAD体系中的H₂的主要来源是阴极和NADH,电解电压的扰动会影响H₂的产生,进而会影响产甲烷通量。在0.6 V扰动后,生物膜中Trichloromonas的相对丰度高达 40.2%,分别是1.0 V和1.4 V的1.52倍和1.13倍,同时CoI、PTA、AK与CoF₄₂₀均表现出最佳的酶活水平,关键酶活水平和Trichloromonas的相对丰度与产甲烷代谢通量表现出较好的一致性,而阳极生物膜中微生物多样性也是影响EAD产甲烷通量的重要因素。     

电压扰动对EAD代谢通量中微生物与关键酶活性的影响

为探究电压扰动对EAD代谢通量中微生物与关键酶活性的影响,实验采用单室EAD反应器,以电解电压为扰动变量,利用CNA构建代谢模型,对扰动前后微生物群落、酶活水平及通量变化进行讨论。结果表明,电压扰动后,产甲烷途径偏向于氢营养型产甲烷,约占38.5%,且0.6 V扰动时表现出最佳的甲烷通量,为0.5222 g。EAD体系中的H₂的主要来源是阴极和NADH,电解电压的扰动会影响H₂的产生,进而会影响产甲烷通量。在0.6 V扰动后,生物膜中Trichloromonas的相对丰度高达 40.2%,分别是1.0 V和1.4 V的1.52倍和1.13倍,同时CoI、PTA、AK与CoF₄₂₀均表现出最佳的酶活水平,关键酶活水平和Trichloromonas的相对丰度与产甲烷代谢通量表现出较好的一致性,而阳极生物膜中微生物多样性也是影响EAD产甲烷通量的重要因素。     

Serendipitous Identification of a Covalent Activator of Liver Pyruvate Kinase

Enzymes are effective biological catalysts that accelerate almost all metabolic reactions in living organisms. Synthetic modulators of enzymes are useful tools for the study of enzymatic reactions and can provide starting points for the design of new drugs. Here, we report on the discovery of a class of biologically active compounds that covalently modifies lysine residues in human liver pyruvate kinase (PKL), leading to allosteric activation of the enzyme (EC₅₀=0.29 μM). Surprisingly, the allosteric activation control point resides on the lysine residue K282 present in the catalytic site of PKL. These findings were confirmed by structural data, MS/MS experiments, and molecular modelling studies. Altogether, our study provides a molecular basis for the activation mechanism and establishes a framework for further development of human liver pyruvate kinase covalent activators.     

Connecting Active‐Site Loop Conformations and Catalysis in Triosephosphate Isomerase: Insights from a Rare Variation at Residue 96 in the Plasmodial Enzyme

Despite extensive research into triosephosphate isomerases (TIMs), there exists a gap in understanding of the remarkable conjunction between catalytic loop‐6 (residues 166–176) movement and the conformational flip of Glu165 (catalytic base) upon substrate binding that primes the active site for efficient catalysis. The overwhelming occurrence of serine at position 96 (98 % of the 6277 unique TIM sequences), spatially proximal to E165 and the loop‐6 residues, raises questions about its role in catalysis. Notably, Plasmodium falciparum TIM has an extremely rare residue—phenylalanine—at this position whereas, curiously, the mutant F96S was catalytically defective. We have obtained insights into the influence of residue 96 on the loop‐6 conformational flip and E165 positioning by combining kinetic and structural studies on the PfTIM F96 mutants F96Y, F96A, F96S/S73A, and F96S/L167V with sequence conservation analysis and comparative analysis of the available apo and holo structures of the enzyme from diverse organisms.     

Fusion Enzymes Involved in Biosynthetic Tailoring Reactions in Fungi

Enzyme fusion, the fusion of enzymes with different domains to a single protein, has been widely recognized as a promising strategy in the development of biocatalysts. Nature has evolved gene fusion to combine different catalytic enzymes to function as a fusion enzyme, and this strategy is utilized in many natural product biosynthetic pathways. Owing to rapid advances in genome sequencing and biosynthetic pathway characterization, there is increasing interest in fusion enzymes from fungal biosynthetic pathways, particularly those involved in tailoring steps. This concept aims to provide an up-to-date overview of fusion enzymes that catalyze tailoring reactions in the biosynthesis of fungal secondary metabolites. Since fungal fusion enzymes are often associated with novel metabolites, this pioneering work may stimulate the exploration of the structural diversity of fungal natural products through genome mining of the untapped biosynthetic pathways involving fusion enzymes.