维生素A生物合成的研究进展

维生素A是维持人体代谢的必需维生素,在食品、药品及护肤品等多个领域占有重要地位,是三大维生素支柱产品之一,应用前景广阔。市场上的维生素A主要来源于化学合成和天然提取。近年来,随着绿色生物制造的发展,维生素A的生物合成研究取得了重大的进展。总结了维生素A生物合成的研究现状,并对维生素A生物合成的优化改造方案进行了分析归纳,概述了维生素A发酵生产以及产品组分调控和储存策略,最后对生物合成维生素A的现状进行总结与展望。     

影响多步脱氢酶CrtI功能的关键结构特征探索

在生物体内存在可催化多步连续反应的通用酶,对生物代谢过程具有重要作用。八氢番茄红素脱氢酶（CrtI）作为典型代表,可以催化多步连续脱氢反应,生成番茄红素等具有重要价值的产物。本文以酿酒酵母为底盘研究CrtI的催化功能特征。首先通过组合设计与筛选番茄红素合成路径中的三种外源酶CrtE、CrtB和CrtI,发现CrtI是主要的限制因素,且三孢布拉氏霉菌来源的CrtI(BtCrtI)表现出优异的催化功能。通过生物信息学与蛋白结构分析发现BtCrtI的S311残基是连接和稳定活性中心结构的关键。随后通过分析该位点的饱和突变结果,揭示了该位点的氨基酸残基类型对活性中心结构和功能的显著作用,为酶的设计和改造提供了新的思路。同时发现CrtI的活性差异未对合成路径中的类胡萝卜素的代谢流造成扰动,表明CrtI是番茄红素的产量和纯度的决定因素。     

生物合成槲皮素糖苷类衍生物的研究进展

糖苷类天然产物是植物中次级代谢产物的主要存在形式，具有重要的生物活性。通过糖基化修饰可以改变其水溶性、稳定性，产生特殊的生物活性和功能，因此易于商品化应用，具有重要的药用价值和工业价值，尤其在抗癌药物和日化用品中有着广泛应用。近年来糖苷类产物的生物合成也取得了重大的进展。以重要的糖苷化合物槲皮素为例介绍了糖苷化合物的生物合成，从糖基转移酶和前体供应等角度阐述了生物高产糖苷类化合物的工程策略,为利用合成生物学技术获得植物糖苷的高产菌株提供了技术参考。     

重组尿酸酶发酵培养及制备的工艺条件

利用含PET-Urate Oxidase表达质粒的重组E.coli JM109(DE3)菌株进行大规模发酵培养,拟建立一种高效、低成本的生产重组尿酸酶的技术工艺路线。取冻存的工程菌接种于含质量分数1%琼脂的种子培养基中进行培养,从划线平板上挑取单菌落接种于摇瓶中继续培养,最后以体积分数5%接种量接种于发酵培养基中,绘制生长曲线;以乳糖作为诱导剂与传统IPTG诱导方法进行发酵培养比较;菌体经高压均质机破碎、质量分数40%~60%硫酸铵分级沉淀,以及Q-Sepharose F.F.层析进行分离纯化。结果显示,乳糖作为诱导剂在300 L的发酵罐中进行培养可获得菌体湿质量2 700 g,目的蛋白质表达量占菌体可溶性蛋白质的30%左右,略高于IPTG诱导的效果;经分离纯化后该酶的纯化倍数可达原来的4.5倍,活性回收率为40%;纯化的重组尿酸酶经SDS-PAGE和HPLC分析,显示单一蛋白质色带和单一洗脱峰。成果为该酶的医学实际应用奠定了理论实验基础。     

生物支架系统在合成生物学中的应用

合成生物学作为一种新兴的工程化生物学，可以在底盘细胞中引入外源基因模块实现新功能。但是如何将多种外源模块（酶）进行有效地组装从而提高其协同催化功能是急需解决的一个重大问题。由于异源酶在新宿主中存在内源环境适应性问题，限制了酶的生物活性。生物支架系统作为一种有效手段，可以提供有效的多酶组装系统。恰当的生物支架能够提供适应环境的柔性平台，实现多酶体系的表达调控，稳定性组装，利于酶与底物结合的区域化设计。本综述对不同类型的生物支架的研究进展进行了系统的总结。文中根据不同类型支架（蛋白型、核酸型）的特点，介绍了典型的应用范例，论述了每种支架的优势与不足，并对生物支架的常见工作机制做了详细讨论。最后对生物支架在人工细胞器设计和复杂聚合物降解等方面的应用做出展望。     

产蒎烯人工酵母细胞的构建

蒎烯可衍生为高能量密度燃料,但在酿酒酵母中的全生物合成却未见报道。酿酒酵母由于拥有强大的蛋白表达和翻译后修饰系统以及完整的内膜系统,相比于大肠杆菌等原核生物更适于P450等蛋白的表达,因此将酿酒酵母作为宿主细胞,对于蒎烯或者其他物质实现如“疯狂碳环”的高能量化是至关重要的。本研究在酿酒酵母底盘中表达内源焦磷酸香叶酯合成酶（ERG20）的突变体ERG20^ww和火炬松来源的蒎烯合酶（PtPS）构建了蒎烯的合成路径。通过截短PtPS N端2～51位氨基酸残基（tPtPS）,蒎烯产量较初始产量（0.329 mg·L^-1）提高了2.23倍。在过表达异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI1）和RNA聚合酶Ш负调控因子（MAF1）的基础上,表达ERG20^ww和tPtPS的融合蛋白,蒎烯产量进一步提高了5.16倍。通过将内源基因ERG20启动子原位替换为弱启动子HXT1,下调ERG20的转录,蒎烯的产量提高了26.0%。最终通过调节发酵过程中的培养基pH使蒎烯产量达11.7 mg·L^-1,较初始产量提高了34.5倍。本研究在酿酒酵母中实现蒎烯的从头合成,并获得已知蒎烯摇瓶水平的最高产量。     

高通量筛选技术在菌种进化中的研究进展

菌种进化工程是绿色生物制造的重要策略，利用高效的高通量筛选方法和技术可以快速地获得理想的实用菌株。针对菌种进化工程中的高通量筛选方法，本文重点综述了基于颜色或荧光、基于细胞生长、基于生物传感器以及基于液滴微流体平台等4个方面的高通量筛选技术的重要进展，同时也介绍了各种高通量筛选技术的应用范围和特点，为研究人员从不同进化文库中获得生理特性或者代谢能力显著提高的目标菌株提供了理论指导，极大地提高进化文库的筛选效率，降低了菌株筛选的时间和成本。最后展望了人工智能、合成生物学以及生物信息学的发展对高通量筛选技术的重要影响，以期提高高通量筛选技术的精度、效率和应用范围，进而加速菌种进化过程和工业化进程。     

产蒎烯人工酵母细胞的构建

蒎烯可衍生为高能量密度燃料,但在酿酒酵母中的全生物合成却未见报道。酿酒酵母由于拥有强大的蛋白表达和翻译后修饰系统以及完整的内膜系统,相比于大肠杆菌等原核生物更适于P450等蛋白的表达,因此将酿酒酵母作为宿主细胞,对于蒎烯或者其他物质实现如"疯狂碳环"的高能量化是至关重要的。本研究在酿酒酵母底盘中表达内源焦磷酸香叶酯合成酶(ERG20)的突变体ERG20ww和火炬松来源的蒎烯合酶(PtPS)构建了蒎烯的合成路径。通过截短PtPS N端2～51位氨基酸残基(tPtPS),蒎烯产量较初始产量(0.329 mg·L~(-1))提高了2.23倍。在过表达异戊二烯焦磷酸异构酶(IDI1)和RNA聚合酶Ш负调控因子(MAF1)的基础上,表达ERG20ww和tPtPS的融合蛋白,蒎烯产量进一步提高了5.16倍。通过将内源基因ERG20启动子原位替换为弱启动子HXT1,下调ERG20的转录,蒎烯的产量提高了26.0%。最终通过调节发酵过程中的培养基pH使蒎烯产量达11.7 mg·L~(-1),较初始产量提高了34.5倍。本研究在酿酒酵母中实现蒎烯的从头合成,并获得已知蒎烯摇瓶水平的最高产量。     

维生素A生物合成的研究进展

维生素A是维持人体代谢的必需维生素,在食品、药品及护肤品等多个领域占有重要地位,是三大维生素支柱产品之一,应用前景广阔。市场上的维生素A主要来源于化学合成和天然提取。近年来,随着绿色生物制造的发展,维生素A的生物合成研究取得了重大的进展。总结了维生素A生物合成的研究现状,并对维生素A生物合成的优化改造方案进行了分析归纳,概述了维生素A发酵生产以及产品组分调控和储存策略,最后对生物合成维生素A的现状进行总结与展望。     

影响多步脱氢酶CrtI功能的关键结构特征探索

在生物体内存在可催化多步连续反应的通用酶,对生物代谢过程具有重要作用。八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)作为典型代表,可以催化多步连续脱氢反应,生成番茄红素等具有重要价值的产物。本文以酿酒酵母为底盘研究CrtI的催化功能特征。首先通过组合设计与筛选番茄红素合成路径中的三种外源酶CrtE、CrtB和CrtI,发现CrtI是主要的限制因素,且三孢布拉氏霉菌来源的CrtI (BtCrtI)表现出优异的催化功能。通过生物信息学与蛋白结构分析发现BtCrtI的S311残基是连接和稳定活性中心结构的关键。随后通过分析该位点的饱和突变结果,揭示了该位点的氨基酸残基类型对活性中心结构和功能的显著作用,为酶的设计和改造提供了新的思路。同时发现CrtI的活性差异未对合成路径中的类胡萝卜素的代谢流造成扰动,表明CrtI是番茄红素的产量和纯度的决定因素。