问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB_2和fliR的克隆及原核表达系统的构建

目的克隆问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR,并构建其原核表达载体。方法按常规苯酚-氯仿法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组DNA,高保真PCR扩增flhA、flhB2和fliR基因片段,T-A克隆后测序,构建原核表达载体,采用SDS-PAGE和免疫印迹法检测目的融合蛋白的表达。结果问号钩体56601株flhA、flhB2和fliR基因扩增片段的核苷酸序列与报道的相应序列同源性分别为100%、99·9%和99·9%,氨基酸序列同源性分别为100%、99·8%和100%。所构建的重组原核表达系统在IPTG的诱导下,能有效地表达目的融合蛋白Trx-FlhA、Trx-FlhB2和Trx-FliR,产量约为细菌总蛋白的10%。结论已成功构建了问号钩端螺旋体鞭毛相关基因flhA、flhB2和fliR原核表达系统。     

问号钩体Ⅱ型分泌系统相关基因特征分析

目的　分析问号钩体Ⅱ型分泌系统相关基因特征。方法　根据问号钩体黄疸出血群赖型赖株全基因组数据库 ,应用BLAST ,Tmpred ,Pfam等软件分析问号钩体Ⅱ型分泌系统的基因组成和编码蛋白的结构特征 ,并比较问号钩体与铜绿假单胞菌和大肠埃希菌K12Ⅱ型分泌系统组成蛋白的同源性。结果　问号钩体中与Ⅱ型分泌系统相关的蛋白有 11个 ,其中 6个为一般分泌途径蛋白 ,5个为Sec分泌途径蛋白 ,问号钩体中可能存在Ⅱ型分泌系统 ,但一些辅助蛋白未发现 ,需要进一步研究。结论　初步预测了问号钩体中Ⅱ型分泌系统的作用模式 ,为深入研究问号钩体的致病机制奠定基础     

钩端螺旋体外膜蛋白基因重组载体构建及在卡介菌中的表达

目的　研制一种高效广谱的新型钩体疫苗。方法　用PCR方法扩增致病性钩端螺旋体赖型 0 17株外膜蛋白OmpL1基因 ,将其克隆入大肠杆菌—分枝杆菌穿梭质粒载体pMV2 6 1和pMV36 1中。结果　筛选到两个重组载体pBQ1和pBQ2 ,通过电穿孔导入卡介菌 ,重组体经诱导表达了相对分子质量约为 35 0 0 0的融合蛋白。结论　卡介菌能有效表达钩体抗原蛋白     

奶牛乳房炎致病大肠埃希菌的分型及外膜蛋白酶OmpT的抗原性验证

目的对奶牛乳房炎致病大肠埃希菌(E.coli)进行分型及外膜蛋白酶T(outer membrane protease,OmpT)的抗原性验证。方法采用凝集试验测定黑龙江省分离的84株致病E.coli的O血清型,PCR扩增种系分类群标记基因法对84株E.coli进行分型;经BLAST比对筛选ompT基因后,PCR验证ompT基因的普遍性;克隆A、B1、D群代表株ompT基因,测序后进行同源性比对;构建B1群E.coli 2002-1株ompT基因重组表达质粒pET-32a-ompT,转化E.coliRosetta,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,Western blot法鉴定重组蛋白的抗原性。结果 84株奶牛乳房炎致病E.coli中共鉴定出血清型51株,覆盖42个O血清型,归属A种系进化群10株,占11.90%;B1种系进化群74株,占88.10%;无肠外强致病的B2和D群。各型E.coli均可扩增出ompT基因。4亚群代表株ompT基因具有高度保守性,同源性达97%以上。重组表达质粒pET-32a-ompT经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约55 000,诱导4 h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的29.8%。纯化的重组OmpT蛋白纯度为87.6%,与4亚群E.coli免疫血清均可发生特异性反应。结论种系进化是对奶牛乳房炎致病E.coli分型的理想方法,外膜蛋白酶OmpT在E.coli各种系进化群中抗原性良好,可作为研制E.coli蛋白亚单位疫苗的候选抗原。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性。方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C)。将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化。结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别。VP1C重组蛋白纯度达84.1%。结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因。     

以结核分枝杆菌38kD重组蛋白为抗原的血清学诊断

目的克隆表达结核分枝杆菌38kD抗原基因,并以此蛋白为抗原,进行分枝杆菌的血清学诊断。方法采用PCR自结核分枝杆菌基因组DNA中扩增38kD抗原基因,经测序鉴定正确后,克隆于pGEX-4T-2表达载体,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物,经ELISA检测其抗原的灵敏度与特异性。结果目的蛋白表达量约占菌体总蛋白量的28%,ELISA检测灵敏度为79.8%,特异性为99.0%。结论重组38kD抗原可用于结核分枝杆菌的诊断。     

水泡性口炎病毒核蛋白基因的克隆和序列分析

目的　对水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因进行PCR扩增、克隆和序列分析。方法　将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18 T载体中 ,构建N基因重组质粒载体。进行PCR及限制性内切酶分析 ,筛选获得N基因插入的阳性克隆。经核苷酸序列分析 ,并与Genbank中的VSV编码核衣壳蛋白N基因序列进行比较。结果　该序列与VSVNewJersey型的 0 9/ 82 HD B株同源性最高 ,核苷酸和推测氨基酸的同源性分别为 98.9%和 98.8% ,有 13个核苷酸差异 ,伴有 5个氨基酸改变 ,第 72位的酪氨酸变为组氨酸 ,第 89位的缬氨酸变为异亮氨酸 ,第 183位的天冬氨酸变为天冬酰胺 ,第 2 0 5位的苯丙氨酸变为亮氨酸 ,第 4 18位的丙氨酸变为缬氨酸 ;与In diana型各株的同源性较低 ,与Glasgow株相比 ,核苷酸和氨基酸的同源性分别为 6 7.9%和 71.6 %。结论　已成功地克隆了水泡性口炎病毒N基因 ,为水泡性口炎免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础     

输血传播病毒ORF2基因的克隆和原核表达

目的克隆输血传播病毒(TTV)兰州株ORF2的基因,并构建原核表达载体。方法通过巢式PCR,从一份兰州地区无偿献血员血清中扩增TTV病毒的ORF2基因,并克隆到pGEM-T载体中,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆到高效表达质粒pET22b(+)中,构建表达载体ORF2-pET22,在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF2融合蛋白。用纯化的重组ORF2蛋白作为抗原,ELISA检测人血清样本中的TTV-IgG抗体。结果ORF2基因与日本TA287株的同源性为99.3%。用TTV-PCR阳性的血清对重组蛋白进行了Western blot,结果在表达蛋白位置处出现了特异性反应条带。以ORF2蛋白为抗原的ELISA检测结果具有较好的准确性。结论已成功克隆了ORF2基因,并在原核细胞中表达。     

广西流行的猪瘟病毒株E2基因序列测定及分析

目的对广西流行的猪瘟病毒E2基因进行序列测定及分析。方法应用PCR对15株猪瘟病毒E2基因进行扩增、克隆及测序,利用DNAstar分析软件对所测定的15株毒株与兔化弱毒(HCLV)、石门(Shimen)毒株的相应基因片段进行同源性分析。结果得到长度为1092nt猪瘟病毒E2基因,编码364个氨基酸残基的目的基因片段。广西株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为81.5%～82.8%和82.8%～84.3%,推导的氨基酸同源性分别为87.1%～88.8%和88.5%～89.9%,广西毒株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为92.3%～99.9%和94.8%～100%。广西15株猪瘟病毒E2蛋白上的全部半胱氨酸(Cys)位点均未改变,推测其E2蛋白的抗原结构保持很高的稳定性。但广西毒株中与特定单克隆抗体结合的724、725、729、734和738位的氨基酸发生了变异,这些变异可能导致不完全免疫保护。把所测定的广西15株与国内外已发表的19株病毒相应序列进行比较,建立系统发育树,所比较的34株猪瘟病毒被分为两个群,广西毒株皆属于基因群Ⅱ。结论成功进行了广西流行猪瘟病毒E2基因序列分析,为进一步探讨猪瘟病毒E2蛋白的抗原结构提供了依据。     

基因工程龋齿疫苗菌株的构建

采用PCR技术，扩增出两端分别增添了EcoR1和BamH1酶切位点的变链菌GTF基因，将其与高效表达的质粒PBV220载体连接后，克隆到大肠杆菌中，成功地构建出一株高效表达GTF基因的菌株。该菌株培养方法简便，GTF抗原表达量高，稳定性好，抗原主要存在于细胞内部，无包涵体形成，用所提的GTF抗原免疫家兔具有明显的免疫原性．是制备龋齿疫苗较为理想的工程菌株。     

HIV-1 HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,表达并纯化Ta(tB41-101N)融合蛋白,为进一步研究其免疫原性奠定基础。方法在HIV-1HXB2株天然Tat蛋白N-端添加Tat41-101位氨基酸(aa),采用PCR法从HIV-1HXB2株tat基因中扩增分别编码Tat41-101aa和Tat1-101aa的tat41-101和tat1-101两个基因片段,重叠延伸PCR法扩增其融合基因ta(tB41-101N),并构建其原核表达质粒pET32a-ta(tB41-101N),经双酶切及测序验证后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。融合蛋白经Ni2+-NTA柱亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Westernblot及ELISA鉴定。结果重叠延伸PCR扩增出约500bp的ta(tB41-101N)融合基因,酶切及测序结果表明重组表达质粒pET32a-ta(tB41-101N)构建正确。SDS-PAGE分析显示,表达的Ta(tB41-101N)融合蛋白相对分子质量约为36000,约占菌体总蛋白的7%,纯化后纯度约为60%;Westernblot和ELISA分析显示,Ta(tB41-101N)融合蛋白与小鼠抗Tat单抗及抗-HIV阳性血清(抗Tat抗体阳性)均呈特异性阳性反应。结论已成功构建了HIV-1HXB2株ta(tB41-101N)融合基因原核表达质粒,并表达了其融合蛋白,该蛋白较好地保留了天然Tat蛋白的免疫反应性,为Tat新型疫苗的研究奠定了基础。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒HE基因的克隆及原核表达

目的构建猪血凝性脑脊髓炎病毒株(67N)血凝素酯酶蛋白(HE蛋白)原核表达系统,为建立特异性免疫学诊断方法提供备选材料。方法克隆猪血凝性脑脊髓炎病毒(67N)HE蛋白抗原表位富集区基因,构建重组表达质粒pET-HE,并在大肠杆菌中诱导表达。经包涵体的初步纯化,金属螯合层析进一步纯化HE蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测。结果大肠杆菌可高效表达HE蛋白,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的42.2%。纯化后蛋白浓度为0.6 mg/ml,纯度为85.4%。所表达的蛋白可被兔抗猪血凝性脑脊髓炎阳性血清所识别。结论已成功构建猪血凝性脑脊髓炎病毒HE蛋白原核表达载体,重组HE蛋白抗原具有良好的特异性,可作为检测猪血凝性脑脊髓炎病毒血清抗体的候选抗原。     

二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达

目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

丝状支原体丝状亚种SC型LppQ N-端基因表达与免疫原性

目的构建丝状支原体丝状亚种SC型LppQN端基因表达载体,并进行表达产物的纯化及免疫原性检测。方法利用PCR方法在体外定点突变丝状支原体丝状亚种SC型HVRIX株编码色氨酸的基因(TGA突变为TGG),构建表达载体,使其能在大肠杆菌中大量表达,并对表达产物进行纯化和免疫原性检测。结果表达产物约占菌体总蛋白的53.7%,经Westernblot和ELISA检测,表达蛋白具有良好的免疫原性。结论已成功表达了具有免疫原性的LppQ重组表达蛋白,可以作为诊断抗原用于血清学检测。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

弓形虫亲环蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)基因。方法收集、纯化Rh株弓形虫速殖子,提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增TgCyP基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-TgCyP,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果测序结果与GenBank中登录的基因序列同源性为100%,重组表达质粒pET-28a-TgCyP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白的相对分子质量约为26000,表达量约占菌体总蛋白的40%,Western blot显示其能被鼠抗弓形虫免疫血清识别。结论已在E.coliBL21(DE3)中表达了Rh株TgCyP,其有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。