金黄色葡萄球菌GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及其活性

目的在大肠埃希菌中融合表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus,S.aureus)GapC蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白,并检测其甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性。方法采用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白flic基因和S.Aureus GapC基因,通过overlap PCR将这两段基因拼接并克隆至载体pQE30a,构建重组表达质粒pQE30-flic-GapC,将重组表达质粒转化E.coli XL-blue,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析试剂盒纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析,并检测其GAPDH活性。结果重组表达质粒pQE30-flic-GapC经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达产物相对分子质量约95 000,最佳诱导表达时间为5 h,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的31.4%;纯化产物可与小鼠抗S.aureus全菌体多抗血清和抗鼠伤寒沙门菌全菌体多抗血清发生特异性反应,GAPDH活性为(0.337±0.019)。结论成功表达并纯化了具有较高生物学活性的flic-GapC融合蛋白,为S.aureus亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

猪源枯草芽孢杆菌喷雾干燥工艺的优化

目的优化猪源枯草芽孢杆菌喷雾干燥工艺,提高菌体喷雾干燥后的存活率。方法应用SAS V 8.0统计分析软件中的二次正交旋转组合设计方案进行试验设计,分析各因素对Y值的效应关系;应用优化的喷雾干燥工艺进行3次重复喷雾干燥试验,验证预测结果的准确性;并检测芽孢率对菌体喷雾干燥存活率的影响。结果优化的喷雾干燥工艺中各条件的最佳参数为:出口温度90℃,入口温度150℃,保护剂浓度20%,入料速度1 200 ml/h;应用优化的喷雾干燥工艺进行3次重复喷雾干燥试验,菌体平均存活率为75.7%,与预测值(77%)基本相符;芽孢率对菌体喷雾干燥存活率影响较大。结论优化了猪源枯草芽孢杆菌的喷雾干燥工艺,为其工业化生产奠定了基础。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

IBRV TaqMan-MGB实时荧光定量PCR方法在BVDV和IBRV共感染中病毒定量检测的应用

目的应用牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)Taq Man-MGB实时荧光定量PCR方法进行牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和IBRV共感染的病毒定量检测,进一步研究BVDV和IBRV共感染后BVDV对IBRV复制的影响。方法分别用0.2和1.0 MOI的BVDV感染MDBK细胞,待细胞出现50%CPE时,再用0.1 MOI的IBRV共感染,作用24 h后收集样品,采用Taqman-MGB实时荧光定量PCR方法检测IBRV的拷贝数,并与对照组(IBRV单独感染组)进行比较。结果在先感染0.2和1.0 MOI BVDV情况下,IBRV拷贝数分别为3.0×10~6和6.47×10~6拷贝/μL,单独感染IBRV的对照组的拷贝数为1.15×10~7拷贝/μL。结论在体外情况下,BVDV对IBRV的复制影响较小,为研究BVDV和IBRV的共感染机制以及制备BVDV和IBRV感染同一细胞的二联苗奠定了基础。     

二次正交旋转组合设计优化猪源罗伊乳杆菌冷冻干燥保护剂

目的优化猪源罗伊乳杆菌冷冻干燥的保护剂配方,提高冻干后的菌体存活率。方法应用SASV8.0统计分析软件中的二次正交旋转组合设计方案,进行冷冻干燥保护剂组分配比优化的试验设计,并通过响应面法分析各因素对响应值的效应关系。应用优化的冻干保护剂配方进行3次重复冻干试验,验证预测结果的准确性。结果经优化后,保护剂各组分最佳配比为:蔗糖15%,甘油3%,山梨醇15%,脱脂乳15%。应用优化保护剂进行的3次重复冻干试验,菌体冻干存活率的平均值为71.6%,与预测值(73.6%)基本相符。结论应用二次正交旋转组合设计结合响应面法,优化了猪源罗伊乳杆菌的冷冻干燥保护剂组分。     

牛产气荚膜梭菌α-ε毒素基因的融合表达及其纯化

目的融合表达产气荚膜梭菌α毒素基因和ε毒素基因的融合基因α-ε,并进行纯化。方法利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌C57-8株基因组DNA中扩增出α毒素基因的部分基因片段,插入到质粒p ET28a-ε上,构建含α-ε融合毒素基因的表达质粒p ET28a-α-ε,转化至E.coli BL21(DE3)plys S感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组质粒p ET28a-α-ε经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,与预期的基因序列重合率为99%。表达的重组蛋白相对分子质量约78 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的22.7%,纯度为91.2%,可与小鼠产气荚膜梭菌多抗血清特异性结合,具有良好的反应原性。结论成功构建了重组质粒p ET28a-α-ε,并在E.coli BL21(DE3)plys S中表达了重组α-ε融合蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防牛肠毒血症基因工程亚单位疫苗的候选抗原。     

应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌GapC1的大肠埃希菌

目的应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌Gap C1-150 aa(Gap C1)的大肠埃希菌,为进一步构建大肠埃希菌表面展示重组菌株奠定基础。方法根据Gen Bank中登录的gap C基因序列(GI:30348860)设计引物,以质粒p KD3、p QE30/lpp-omp A-gap C为模板进行PCR扩增、融合,获得融合片段,转化入含p KD46质粒的大肠埃希菌HB101中,利用p KD46编码的RED系统将融合片段重组入基因组中,经氨苄西林(Amp)和氯霉素(Cm)抗性筛选,获得去除p KD46质粒的重组菌(HB101LOG)。对重组菌株进行PCR、Western blot、流式细胞术、荧光显微镜及生物学特性检测。结果 PCR结果显示,重组菌株构建正确;重组大肠埃希菌HB101LOG在菌体表面表达了外源蛋白Gap C1-150 aa;激光共聚焦显微镜观察到HB101LOG可见明显的绿色荧光,HB101未见绿色荧光;重组菌株HB101LOG和HB101的生长曲线符合大肠埃希菌的生长规律。结论应用RED系统成功构建了能展示链球菌Gap C1-150 aa的大肠埃希菌重组菌株。     

无乳链球菌GapC蛋白和鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及纯化

目的构建无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)gapC基因和鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimu-rium,S.typhimurium)fliC基因的融合基因gapC-fliC,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因和无乳链球菌gapC基因片段,通过柔性肽(Gly4Ser)2编码序列将二者串联并克隆至质粒pQE-30上,构建重组原核表达质粒fliC-gapC-pQE30,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行Western blot分析及融合蛋白活性检测。结果重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白FliC-GapC相对分子质量约95 000,表达量占菌体总蛋白的58%,主要以包涵体形式存在,且可与小鼠抗鼠伤寒沙门菌和抗无乳链球菌多抗血清发生特异性反应,具有较好的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性。结论成功构建了重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30,并在E.coli XL1-Blue中表达了融合蛋白,为下一步动物免疫保护性试验的研究奠定了基础。     

奶牛乳房炎致病大肠埃希菌的分型及外膜蛋白酶OmpT的抗原性验证

目的对奶牛乳房炎致病大肠埃希菌(E.coli)进行分型及外膜蛋白酶T(outer membrane protease,OmpT)的抗原性验证。方法采用凝集试验测定黑龙江省分离的84株致病E.coli的O血清型,PCR扩增种系分类群标记基因法对84株E.coli进行分型;经BLAST比对筛选ompT基因后,PCR验证ompT基因的普遍性;克隆A、B1、D群代表株ompT基因,测序后进行同源性比对;构建B1群E.coli 2002-1株ompT基因重组表达质粒pET-32a-ompT,转化E.coliRosetta,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,Western blot法鉴定重组蛋白的抗原性。结果 84株奶牛乳房炎致病E.coli中共鉴定出血清型51株,覆盖42个O血清型,归属A种系进化群10株,占11.90%;B1种系进化群74株,占88.10%;无肠外强致病的B2和D群。各型E.coli均可扩增出ompT基因。4亚群代表株ompT基因具有高度保守性,同源性达97%以上。重组表达质粒pET-32a-ompT经PCR及双酶切鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约55 000,诱导4 h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的29.8%。纯化的重组OmpT蛋白纯度为87.6%,与4亚群E.coli免疫血清均可发生特异性反应。结论种系进化是对奶牛乳房炎致病E.coli分型的理想方法,外膜蛋白酶OmpT在E.coli各种系进化群中抗原性良好,可作为研制E.coli蛋白亚单位疫苗的候选抗原。     

二次正交旋转组合设计优化罗伊乳杆菌发酵培养基

目的优化猪源罗伊乳杆菌的发酵培养基4个组分的配比。方法应用SASV8.0统计分析软件中的二次正交旋转组合设计方案进行试验设计,并通过响应面法分析各因素对响应值的效应关系。结果优化后培养基各组分比例为:大豆蛋白胨5%,葡萄糖1%,酵母浸粉1.7%,低聚糖0.3%。应用此配比进行了3次重复发酵试验,A620的平均值为1.073,与预测值(1.092)基本相符。结论二次正交旋转组合设计结合响应面法可用于发酵培养基组分的优化和分析。