人IL-10 cDNA克隆、表达及其生物学活性

目的 在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10(Human Interleukin,hIL-10)。方法 用RT-PCR自白血病细胞株K562 RNA扩增hIL-10 cDNA片段(约500bp),克隆至质粒载体pSK(+),并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRI和 BamHI消化pSK/IL-10重组质粒,分离hIL-10片段,并插入原核表达载体pBV220的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pBV/IL-10。转化菌株经42℃诱导,用SDS-PAGE和Westem blot鉴定表达的重组蛋白。表达的重组蛋白经谷胱甘肽复性缓冲液复性,用RT-PCR检测其对外周血单核细胞(PBMC)合成IFN-γ的抑制作用。结果 RT-PCR扩增的DNA片段与hIL-10 cDNA大小一致。重组质粒pSK/IL-10的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hIL-10 cDNA序列一致。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为18000,其表达量达菌体总蛋白的20％左右。Westem blot分析显示,重组蛋白能特异性地与抗hIL-10抗体结合,复性的重组蛋白能明显抑制PBMC合成IFN-γ。结论 已成功地构建了表达具有生物学活性的重组hIL-10(Recombinant hIL-10,rhIL-10)的工程菌株。     

人热休克蛋白10在毕赤酵母中的表达及纯化

目的在毕赤酵母中表达及纯化人热休克蛋白10(heat shock protein 10,Hsp10)。方法取新鲜人胎盘组织提取总RNA,反转录合成c DNA。以其为模版PCR扩增Hsp10基因片段,构建外分泌重组表达载体pPIC9KHsp10,电击转化毕赤酵母GS115菌株,经组氨酸缺陷筛选,获得阳性菌株pPIC9K-Hsp10/GS115。重组菌经甲醇诱导,SDS-PAGE检测蛋白含量,Western blot分析Hsp10特异性。结果获取了序列正确的Hsp10基因及高表达菌株。表达产物在相对分子质量11 000处可见特异表达条带,Hsp10蛋白表达量为400 mg/L,纯度大于90%;Western blot分析表明,Hsp10具有良好的反应原性和特异性。结论 Hsp10在毕赤酵母GS115中成功表达,为该蛋白的放大生产及应用奠定了基础。     

产微球茎属（Microbulbifer sp.）FG4菌株琼胶酶功能基因的克隆与表达

以FG4菌株琼胶酶基因侧翼序列为基础，构建重组质粒与载体，从而获得高效产琼胶酶的表达菌株。本研究利用染色体步移法获得FG4菌珠琼胶酶基因功能的侧翼序列之后，将基因组端序列克隆基因片段与表达载体进行重组，并转入到受体细胞BL21中，在鉴定表达菌株的成功构建后利用IPTG诱导表达琼胶酶。实现产微球茎属（Microbulbifer sp.）FG4菌株琼胶酶功能基因的克隆与表达，以期为琼胶酶类在不同领域的实际应用提供理论支持。     

重组人乳铁蛋白基因克隆及表达

目的　构建重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株 ,并对表达产物进行评价。方法　由外周血白细胞总RNA经RT- PCR克隆获得HLF基因结构cDNA ,测序后克隆入酵母表达载体获得质粒pPIC9K- HLF ,线性化后电转化入毕赤酵母 ,经G4 -18 YPD筛选多拷贝后进行甲醇诱导表达。结果　获得基因与GenBank中的人HLF0 1基因基本相符。 2株多拷贝菌株诱导表达产物均能与人HLF抗体反应 ,具有抑制大肠杆菌生长的作用。结论　获得了能分泌有活性HLF的重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株。     

人乳头状瘤病毒16亚型E6E7基因重组腺病毒的构建及其在小鼠骨髓源树突状细胞中的表达

目的 构建人乳头状瘤病毒16亚型(Human papillomavirus 16,HPV16)E6E7基因重组腺病毒,并在小鼠骨髓源树突状细胞(Dendritic cell,DC)中表达。方法双酶切质粒pET-32a(+)-E6E7获得E6E7,基因片段,插入腺病毒穿梭质粒pAd-Track-CMV中,转染HEK293细胞,扩增病毒,经同源重组、包装后获得重组腺病毒pAd-E6E7,转染体外培养的小鼠骨髓源DC,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠DC的形态,流式细胞术检测转染前后小鼠DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C),Western blot检测E6蛋白的表达。结果双酶切及测序证实,重组腺病毒质粒pAd-E6E7构建正确,插入的E6E7基因片段序列正确;转染HEK293细胞48 h,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,重组腺病毒的滴度为3×107 CCID50/ml;重组腺病毒pAd-E6E7感染后DC的状态与成熟DC表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)相符合,感染后的DC表面有许多树枝状、刺状突起,符合成熟DC的表面形态;感染后的DC中存在E6蛋白的表达。结论已成功构建了HPV16 E6E7基因重组腺病毒表达质粒,其能在小鼠骨髓源DC中表达。     

一种肺炎链球菌重组蛋白PsaA-PspA23原核表达载体的构建及表达

目的优化肺炎疫苗重组蛋白基因Psa A-Psp A23的同源区序列,阻止该基因的组氨酸标签(His-tag)融合表达,对突变后的目的基因进行表达及鉴定。方法以肺炎疫苗重组蛋白基因Psa A-Psp A23为模板,设计2对具有重叠区的特异性引物,并分别对该重组基因进行扩增,得到Psa A-Psp A2和Psp A3的CDR区(亚类决定区)基因片段。利用重叠延伸PCR(Overlap PCR)技术,将Psa A-Psp A2基因片段和Psp A3的CDR区基因片段连接,得到同源区优化后的基因片段。利用PCR技术扩增同源区优化后的基因片段,使该基因3′末端引入终止密码子,阻止Psa APsp A23基因表达载体上His-tag的融合表达。将得到的片段同源区优化且无His-tag融合表达的目的基因连接至p ET20b载体后,转入大肠埃希菌(E.coli)中进行表达,表达产物进行Western blot分析。结果重组表达质粒p ET20b-Psa A-Psp A23经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;转化E.coli中,37℃,IPTG终浓度1 mmol/L诱导5 h,获得可溶性表达的重组蛋白,且无His-tag。结论 Psa A-Psp A23蛋白基因同源区优化及His-tag成功去除,并在原核表达系统E.coli中可溶性表达,可为Psa A-Psp A23蛋白疫苗的进一步研究奠定基础。     

共表达蛋白二硫键异构酶对IFNβ-HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响

目的探讨共表达蛋白二硫键异构酶(PDI)对干扰素β与人血清白蛋白(IFNβ-HSA)融合蛋白在毕赤酵母中表达的影响。方法根据GenBank公布的毕赤酵母PDI序列设计引物,利用PCR方法从毕赤酵母基因组中扩增目的基因片段,插入表达载体pPICZαA,并整合入融合蛋白(IFNβ-HSA)基因工程菌中,筛选共表达PDI的重组酵母菌,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,ELISA法检测IFNβ-HSA的表达量。结果经PCR鉴定,重组表达质粒pPICZαA-PDI已转入毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA中。经SDS-PAGE分析,PDI在菌体内大量表达,原始菌株和共表达菌株均明显表达融合蛋白IFNβ-HSA,共表达PDI菌株表达量提高了60%,ELISA法测定达(22.49±3.52)mg/L。结论共表达PDI能促进外源蛋白的分泌表达,为进一步研究在毕赤酵母中过量表达分子伴侣对其分泌外源蛋白的影响奠定了基础。     

Kozak序列引导的人p53基因重组智能腺病毒载体的构建与表达

目的构建Kozak序列引导的人p53(khp53)基因重组智能腺病毒载体rAdMH-khp53,并检测p53基因的表达。方法将带有Kozak序列的p53基因克隆到重组腺病毒穿梭载体中,再利用AdMaxTMHi-IQ系统,获得重组腺病毒,检测病毒滴度,并进一步感染Saos-2细胞,利用RT-PCR及Western blot检测p53基因的表达。结果khp53基因成功克隆到腺病毒载体中,重组腺病毒滴度为1.63×108IU/ml,RT-PCR方法检测到p53基因的转录产物,Western blot检测到p53基因在Saos-2细胞中的高水平表达。结论已成功构建了带有Kozak序列的重组腺病毒载体rAdMH-khp53,并高效表达人p53基因。     

葡萄球菌肠毒素B基因真核表达系统的构建及目的蛋白的鉴定

目的　克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因 ,构建其真核表达系统并表达目的蛋白。方法　采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株中扩增全长SEB ,目的片段T A克隆后测序。重组质粒pUCm T SEB经酶切获得的pUCm T SEB基因片段与真核表达载体pPIC9K连接。将重组真核载体pPIC9K SEB转化入P .pastorisGS115株 ,经PCR筛选并鉴定pPIC9K SEB P .pastorisGS115。在 0 5 % (v v)甲醇诱导下 ,采用SDS PAGE检测重组SEB(rSEB)的表达 ,并对rSEB的N端氨基酸序列和诱导人脐静脉内皮EVC 30 4细胞分泌IL 1α和TNFα的作用进行了检测。结果　所克隆的SEB基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别高达 98 84 %～ 10 0 %和 10 0 %。表达的SEB在SDS PAGE图谱的位置与预期相符。rSEB氨基末端氨基酸序列与预期完全相符。rSEB与SEB商品有相似的促人脐静脉内皮细胞EVC 30 4分泌IL 1α和TNFα的活性。结论　已成功地构建了SEB的真核表达系统 ,为进一步分析SEB分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础。     

金黄葡萄球菌肠毒素C3基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达金黄葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)基因。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增SEC3基因中编码成熟蛋白的基因片段,克隆至pET-32a(+)表达载体,构建重组表达质粒SEC3-pET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经PCR扩增获得720bp的SEC3基因;重组表达质粒构建正确;表达产物的相对分子质量约为43000,为可溶性表达;纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆并原核表达了SEC3基因,为单克隆抗体和诊断试剂的制备及SEC3抗毒素的研制提供了材料。     

人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段的基因克隆和原核表达

目的克隆人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB/AD-1片段并构建其原核表达系统。方法用PCR法从人巨细胞病毒AD169株基因组DNA中扩增gB/AD-1片段并克隆至pGEM-T载体,酶切后,亚克隆至表达载体pET-15b,构建重组表达质粒pET-15b/gB/AD-1,并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析一步纯化,并用Westernblot鉴定。结果gB/AD-1蛋白表达量达到35%。表达产物经纯化后,纯度大于95%。经Westernblot检测,表达产物与CMV阳性人血清发生特异性反应。结论已成功构建重组表达载体pET-15b/gB/AD-1,并在大肠杆菌中高水平表达gB/AD-1。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的串联与原核表达

目的构建C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,并鉴定其表达产物的免疫反应性。方法首先合成C型口蹄疫病毒C-S8C1株VP1基因的3个抗原表位,并克隆到pMD18-T载体上,再按设计的酶切位点酶切后连接,构建出C型VP1双拷贝基因片段(VP1C)。将VP1C基因连接到原核表达载体pET-CKS上,构建重组质粒pETCKS-VP1C,转入BL21菌中进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测其表达产物,并利用包涵体洗涤法对表达产物进行初步纯化。结果VP1C基因在大肠杆菌中获得表达,产量占沉淀蛋白的45%,且表达产物可以被C型口蹄疫病毒标准血清所识别。VP1C重组蛋白纯度达84.1%。结论已成功构建了C型口蹄疫病毒VP1基因原核表达系统,所表达的VP1C有良好的免疫反应性,可以作为检测C型口蹄疫病毒的候选基因。     

人β-NGF蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子β(β-NGF)蛋白,并进行纯化及生物活性检测。方法以人外周血基因组DNA为模板,PCR扩增人β-NGF基因片段,克隆并测序后,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a-β-NGF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用分子筛层析法对表达产物进行纯化,复性后用鸡胚背根神经节培养试验检测其生物活性。结果酶切和测序证实,PCR扩增的人β-NGF基因片段为β-NGF成熟肽编码序列;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的23.5%,主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,表达量为4.8mg/L菌液,且可明显促进鸡胚背根神经节神经突起生长。结论已在大肠杆菌中成功表达了人β-NGF蛋白,纯化后的重组蛋白具有良好的生物活性。     

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达

目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌,并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段,连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌DH5,αIPTG诱导表达,经Western blot鉴定,Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708bp DNA片段,并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000,经Western blot鉴定,与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。     

重组人成骨蛋白-1基因在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达

目的　研究重组人成骨蛋白 -1(rhOP -1)在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达。方法　利用RT -PCR技术 ,从正常胎儿肾组织总cDNA中扩增得到rhOP- 1成熟肽基因片段 ,再将rhOP- 1成熟肽基因克隆于原核融合表达载体pGEX- 4T- 2中 ,构建表达质粒pCCBC- OP- 1,并转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)中 ,在发酵过程中不添加任何诱导剂。表达产物经SDS -PAGE分析。结果　扩增的目的基因序列与文献报道一致。表达的目的蛋白相对分子质量为 14 0 0 0 ,表达量达到菌体蛋白的 4 0 %。结论　克隆了人OP -1成熟肽基因 ,并实现了rhOP- 1的非诱导高效表达。     

百日咳毒素S1亚基片段在大肠杆菌中的表达

目的构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成一个新的基因序列S1′。将该序列与7ZTS表达载体连接,构建重组原核表达质粒7ZTS-S1′,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果S1′基因经PCR鉴定及测序证明与预期相符;重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达蛋白的相对分子质量约17400,表达量约占菌体总蛋白的8%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建百日咳毒素S1亚基片段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为PT单抗及其检测试剂盒的研制奠定了基础。     

人组织激肽释放酶成熟蛋白的纯化及活性分析

目的　制备纯化人组织激肽释放酶 ,并检测其生物活性 ,为中试放大及纯化工艺奠定基础。方法　使用麦芽糖 (MBP)融合分泌载体pMBP P ,构建并筛选出 1株工程菌株 ,在 6L培养基中经IPIG诱导表达人组织激肽释放酶融合蛋白。目的蛋白经亲和层析纯化及凝血酶切割后 ,采用电位滴度法测定其活力。结果　筛选出的工程菌株表达相对分子质量约 70 0 0 0的激肽释放酶融合蛋白 ,大小与预计大小相符。纯化后共获得 2 8mg蛋白 ,并具有水解苯甲酰精胺酸乙酯 (BAEE)的能力。结论　成功进行了人组织激肽释放酶融合成熟蛋白的小量制备 ,经纯化后的产物具有生物活性 ,为中试放大、纯化工艺研究奠定了基础。     

人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达及鉴定

目的构建人巨细胞病毒(HCMV)pp65基因片段(363～505位氨基酸)的原核表达质粒,并鉴定所表达蛋白的反应原性。方法以含有HCMVpp65全长基因的pGEM-T-pp65质粒为模板,PCR扩增pp65基因第1087～1515位核苷酸片段,酶切后插入pET-21a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,纯化后进行Western blot鉴定。结果酶切分析和测序证明原核表达质粒pET-21a(+)-pp65构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,以1.0mmol/L IPTG诱导5h,目的蛋白的表达量最高。纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功构建了HCMV pp65基因片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白。     

人角质细胞生长因子的克隆及表达

目的为获得高表达的重组人角质细胞生长因子生物工程菌。方法应用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从人胚 胎肺成纤维细胞中,扩增出ＫＧＦ ｃＤＮＡ基因,并插入ｐＵＣ１８－Ｔ载体,构建成了重组人ＫＧＦ基因,经ＤＮＡ测序证实与 文献报道一致。将ＫＧＦ基因定向插入大肠杆菌表达载体ＰＥＴ１１ｂ内,转化大肠杆菌ＨＢ１０１。结果获得的重组子 经ＩＰＴＧ诱导,在相对分子质量为１９０００处表达重组蛋白,约占菌体蛋白的１０％。结论建立了制备重组人ＫＧＦ表 达系统,为今后进一步研究ＫＧＦ的生物学功能奠定可靠的物质基础。