双重PCR检测海产品中携带trh毒力基因副溶血性弧菌的研究

为建立有效鉴别副溶血性弧菌及携带耐热相关溶血毒素基因的毒性弧菌的方法,用副溶血性弧菌种属特异性基因tlh及毒性基因trh设计引物进行双重PCR检测,对双重PCR体系进行优化,并对其特异性及PCR灵敏度进行检测,验证双重PCR体系检测能力及对人工污染样品的灵敏度.结果表明,该方法对海产品中的副溶血性弧菌及携带trh毒性基...     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析

通过设计特异性引物,以黑曲霉总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得了预期大小的基因片断.将目的基因使用pMD18-T载体转化到大肠杆菌,质粒PCR鉴定表明已成功克隆了黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因.测序结果表明,获得的目的基因片段大小为2583 bp.该序列与GenBank中的β-葡萄糖苷酶基因序列相比,核苷酸序列同源性达98.88%、氨基酸序列同源性达99.77%.同时,通过PCR技术扩增,获得了去除信号肽的反应产物,大小为2500 bp左右.该结果为目的基因在毕赤酵母中能够使用载体上的信号肽序列进行分泌表达奠定了基础.     

一种用于实时荧光PCR法检测肉制品中鼠源性成分特异性引物的研发

目的研发一种用于实时荧光PCR法检测肉制品中鼠源性成分的特异性引物。方法通过比对NCBI中多种物种的脱氧核糖核酸细胞色素b(mitochondrial deoxyribonucleic acid cytochrome b,Cytb)基因全序列,设计针对鼠源性成分的特异性引物。采用DNA提取试剂盒提取鼠DNA,以其为模板,通过设计的特异性引物进行实时荧光PCR扩增,试验重复3次。同时验证该引物的特异性,并对羊肉卷、牛肉卷和猪肉片样品进行检测。结果通过设计的特异性引物进行3次实时荧光PCR扩增的Cp平均值为16.47,标准差为0.430,熔解曲线具有明显的单一主峰,且重合度良好。仅鼠源DNA模板的PCR产物可见115 bp的目的条带,其他物种DNA模板均未扩增出该目的条带。羊肉卷、牛肉卷和猪肉片样品中均未检测出鼠源性成分。结论本实验设计的引物可用于实时荧光PCR法对肉制品中鼠源性成分的检测,且特异性较好。     

鸭瘟病毒PCR检测方法的建立及验证

目的建立鸭瘟病毒PCR检测方法,并进行验证。方法根据GenBank中登录的鸭瘟病毒基因(UL30、UL31)序列,设计合成1对特异性引物,以鸡胚化弱毒疫苗株病毒基因组DNA为模板,进行PCR扩增。优化PCR的反应条件,并对方法的敏感性、特异性及适用性进行验证。结果经PCR可扩增得到446 bp的目的基因条带,测序结果与已发表的序列同源性达100%。该方法的最低检出限为2.1 pg,对7种鸭易感性病原体及3种鸭瘟病毒同类病原体的检测结果均为阴性。结论已建立了敏感、特异、快速的鸭瘟病毒PCR检测方法。     

甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒的制备

目的制备甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒,并进行验证。方法采用磁珠法从甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品中提取病毒RNA,逆转录合成cDNA。根据NCBI最新公布的大流行甲型H1N1流感病毒(2009)基因序列,设计针对编码基质蛋白M基因的引物和探针,检测甲型流感病毒;设计针对血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因特异性的引物和探针,检测甲型H1N1流感病毒;同时针对人的RNaseP基因设计用于内部控制的引物和探针。所有探针均为Taqman探针,5'端标记FAM,3'端标记BHQ1。对最佳荧光PCR反应条件进行优化,在此基础上组装成甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒,对其特异性、灵敏度、精密性和稳定性进行验证。与市售试剂盒的检测结果进行对比,并对63份临床甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品进行检测。结果设计的PCR引物及探针能对甲型H1N1流感病毒进行准确检测,与流感病毒的其他型和亚型无交叉反应;试剂盒的灵敏度为0.004个血凝素单位;试验内变异系数小于2.5%,批间变异系数小于5%;试剂盒放置-20℃保存,稳定性良好;检测20份甲型H1N1流感疑似患者咽拭子样品的结果与市售试剂盒一致;检测63份流感疑似患者咽拭子样品,其中大流行甲型H1N1流感病毒阳性36份,普通甲型流感病毒阳性5份。结论所制备的甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR诊断试剂盒具有较高的灵敏度、特异性、精密性和稳定性,可用于目前流行的甲型H1N1流感病毒的快速检测。     

聚合酶链式反应技术检测化妆品中的铜绿假单胞菌

利用聚合酶链式反应(PCR)技术建立了一种快速检测化妆品中铜绿假单胞菌的方法。根据已报道的铜绿假单胞菌特异性基因ETA设计引物,确定引物的特异性和灵敏度;对染菌化妆品样品进行增菌检测。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果显示,仅在含有铜绿假单胞菌基因组的样品中得到条带;对染菌样品的扩增结果显示,可以在原样品的活菌浓度为6 cfu.mL-1时通过增菌12 h后检出。     

人源细胞间黏附分子-1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

目的建立并验证细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测不同细胞中ICAM-1的基因水平。方法根据GenBank中登录的ICAM-1基因序列设计并合成引物,建立ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法,验证方法的适用性、线性范围、灵敏性、特异性及精密性。同时采用该方法对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、人星形神经胶质瘤细胞(u251)、人原发性肝癌细胞(PLC/PRF/5)、人胚肾细胞(HEK293)及人脐静脉内皮细胞(HuvEc)进行检测。结果该方法的溶解曲线峰单一,无非特异性产物和引物二聚体;标准质粒在6. 74×10~4～6. 74×10~9 copies/μL浓度范围内与Ct值呈良好的线性关系,线性方程为y=-3. 576 log x+42. 982,R~2=1. 000;建立方法的灵敏性是普通PCR法的10倍;该方法检测不同物种细胞无交叉反应,仅能检出人源细胞ICAM-1;批内和批间CV均1%。不同组织来源的细胞内ICAM-1基因含量不同,其中MRC-5细胞含量最高。结论成功建立了ICAM-1基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,且具有良好的特异性、灵敏性及精密性,可用于ICAM-1基因的定量检测。     

基于529bp高度重复序列的弓形虫PCR诊断方法的建立

目的建立基于529bp高度重复序列的弓形虫PCR诊断方法。方法以弓形虫基因组中529bp的高度重复序列为诊断靶基因设计引物,并以其为模板经PCR扩增该基因,与pMD18-T载体连接,构建pMD18/Tox529bp重组质粒,测序鉴定正确后,经稀释标定作为标准品。优化PCR反应体系及条件,并验证该方法的灵敏度及特异性。结果所构建的pMD18/Tox529bp重组质粒经测序正确,建立的PCR方法最低可检出10个拷贝的目的基因,除对弓形虫基因组DNA扩增出特异性条带外,用该方法对健康志愿者全血、正常小鼠全血、间日疟原虫、恶性疟原虫及结核杆菌基因组DNA均未扩增出特异性条带。结论已建立了一种具有较高灵敏度和特异性的弓形虫PCR诊断方法 ,有望应用于人和动物弓形虫感染的筛查、临床诊断及流行病学调查。     

快速检测淋球菌porA和16S rRNA基因的环介导等温扩增技术的建立

目的建立快速检测淋球菌porA和16S rRNA基因的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,探讨其用于淋球菌感染早期诊断的可行性。方法利用Primer-ExplorerV3软件分别针对淋球菌porA及16S rRNA基因设计6条引物(2条内引物FIP、BIP,2条外引物F3、B3,2条环引物LF、LB),以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板,进行LAMP扩增,同时,以外引物F3、B3为PCR引物,进行PCR扩增,并比较2种扩增方法的灵敏度和特异性。结果LAMP法与PCR法灵敏度相同,可检测到10个拷贝的目的基因;其针对淋球菌porA和16S rRNA基因的引物对脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和大肠埃希菌的DNA均不能扩增。结论已成功建立了检测淋球菌porA和16S rRNA基因的LAMP技术,为淋球菌的快速检测提供了新的手段,有望成为淋球菌常规检测的简便方法。     

土壤微生物16S rDNA V6-V8区PCR反应条件优化

为建立最佳的土壤微生物16S rDNA V6-V8区PCR反应体系和条件,直接从土壤中提取微生物总DNA,经纯化后作为脱氧核糖核酸(DNA)模板,研究了退火温度、引物、dNTPs、Taq聚合酶浓度、Mg2+、模板DNA对扩增反应的影响。结果表明,最佳反应体系为:在20μL反应体系中,正向引物和反向引物的最适浓度均为0.5μmol/L,dNTPs最适浓度0.2 mmol/L,Taq聚合酶量为1 U,Mg2+最适浓度2.0 mmol/L,DNA模板量为10~15 ng。     

The Chemistry of PCR Primers: Concept and Application

DNA is a typical organic compound with marked differences from other chemicals and biopolymers because DNA can be amplified by the enzyme polymerase. DNA can be, in principle, amplified from a single copy by the polymerase chain reaction (PCR). In this review, we focus our attention on the chemistry of PCR primers. Because PCR is basic technology in biology research fields, we sometimes use chemically labeled primers without any awareness of the chemistry they leave behind. We would like to emphasize that chemically labeled primers contain a lot of potential for different chemistry ideas and much study is still necessary to advance PCR for single-nucleotide polymorphism (SNP) typing, genetic diagnosis, and other fields. Two categories of primers, affinity-capture primers and signaling primers, are discussed from the viewpoints of their chemical concepts and applications. Affinity-capture primers are used for purification, isolation, and manipulation of PCR products by high specificity and affinity to the cognate molecules by molecule molecule interactions, whereas signaling primers report the hybridization and/or progress of PCR amplification by a signal change, in most cases by a fluorescence change. The content of this review may be useful for a better understanding of the chemistry of PCR primers and, more importantly, for the invention of novel PCR chemistry.     

聚合酶链式反应技术快速检测化妆品中大肠杆菌的研究

利用聚合酶链式反应(PCR)技术建立了一种快速检测化妆品中大肠杆菌的方法.根据大肠杆菌的ITS保守序列设计特异性引物,确定引物的特异性;比较3种不同提取大肠杆菌DNA的方法,确定煮沸法为最优方法;模拟染菌的化妆品样品,对其进行增菌,并作为模板进行PCR扩增.结果表明,此方法可以在原样品活菌浓度约8×100 cfu/mL时通过12h增菌后检测出来,总的检测时间可以控制在24 h内.     

猪呼吸道疾病综合征4种病原菌复合PCR方法的建立及其初步应用

目的建立检测猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)中肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)、猪链球菌(Streptococcus suis,SS)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)和猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)的四重PCR方法。方法根据GenBank中登录的Mhp的P36基因序列设计引物,同时参考文献分别合成SS、HPS和Pm的特异性引物,通过4因素(Taq酶、Mg2+、引物、dNTPs)4水平的L16(44)正交试验优化PCR反应体系,建立检测Mhp、SS、HPS和Pm的四重PCR方法,并进行特异性、敏感性及重复性验证。运用该方法及单一PCR方法,对PRDC猪的鼻腔拭子及肺脏组织样品进行检测,另对肺脏组织样品进行SS、HPS和Pm的常规分离鉴定。结果确立了四重PCR方法最适反应体系及反应条件;应用建立的四重PCR方法在568、294、821和457 bp处均可见与预期相符的特异性条带,8次重复扩增后的电泳结果一致,最低检测限量分别为560、260、280和200 pg,表明该方法特异性、敏感性及重复性较好;PRDC猪的鼻腔拭子及肺脏组织样品的四重PCR方法检测结果与单一PCR方法相比,差异无统计学意义(P>0.05),四重PCR及单一PCR方法的HPS的检出率则显著高于常规细菌分离鉴定(P<0.05)。结论所建立的四重PCR方法,可直接用于临床PRDC 4种病原菌的鉴定,为开展PRDC流行病学调查提供了有效的技术手段。     

实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导。方法设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法。检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较。结果该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;最低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义。     

New PCR Assays for the Identification of Fusarium verticillioides, Fusarium subglutinans, and Other Species of the Gibberella fujikuroi Complex

Fusarium verticillioides and Fusarium subglutinans are important fungal pathogens of maize and other cereals worldwide. In this study, we developed PCR-based protocols for the identification of these pathogens targeting the gaoB gene, which codes for galactose oxidase. The designed primers recognized isolates of F. verticillioides and F. subglutinans that were obtained from maize seeds from several producing regions of Brazil but did not recognize other Fusarium spp. or other fungal genera that were either obtained from fungal collections or isolated from maize seeds. A multiplex PCR protocol was established to simultaneously detect the genomic DNA from F. verticillioides and F. subglutinans. This protocol could detect the DNA from these fungi growing in artificially or naturally infected maize seeds. Another multiplex reaction with a pair of primers developed in this work combined with a pre-existing pair of primers has allowed identifying F. subglutinans, F. konzum, and F. thapsinum. In addition, the identification of F. nygamai was also possible using a combination of two PCR reactions described in this work, and another described in the literature.     

Enhanced Specificity of Multiplex Polymerase Chain Reaction via CdTe Quantum Dots

Nanoparticles were recently reported to be able to improve both efficiency and specificity in polymerase chain reaction (PCR). Here, CdTe QDs were introduced into multi-PCR systems. It was found that an appropriate concentration of CdTe QDs could enhance the performance of multi-PCR by reducing the formation of nonspecific products in the complex system, but an excessive amount of CdTe QDs could suppress the PCR. The effects of QDs on PCR can be reversed by increasing the polymerase concentration or by adding bovine serum albumin (BSA). The mechanisms underlying these effects were also discussed. The results indicated that CdTe QDs could be used to optimize the amplification products of the PCR, especially in the multi-PCR system with different primers annealing temperatures, which is of great significance for molecular diagnosis.     

菌落PCR技术检测化妆品中金黄色葡萄球菌

利用菌落PCR技术，以金黄色葡萄球菌的特有基因femA为靶基因，选择特异引物．进行扩增，鉴定化妆品中金黄色葡萄球菌。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果显示，仅在含有金黄色葡萄球菌基因组的样品中得到条带。     

猪肺炎支原体环介导等温扩增检测方法的建立

目的建立检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mh)的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal am-plification,LAMP)方法。方法根据GenBank中登录的猪肺炎支原体的核苷酸序列,设计4条特异性引物,用外引物进行PCR反应,对内外引物浓度、dNTP+和MgSO4浓度及Bst DNA聚合酶用量等进行优化,建立猪肺炎支原体LAMP检测方法,并对该方法进行特异性和敏感性验证。结果内外引物浓度分别为0.5和0.20 pmol/μl,dNTP+浓度为0.5 mmol/L,MgSO4浓度为3.75 mmol/L,Bst DNA聚合酶用量为8.0和9.6 U时,LAMP反应效果较好;应用该方法检测多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌均呈阴性;当猪肺炎支原体的拷贝数低于3时,检测不到该病原体。结论已建立了猪肺炎支原体LAMP检测方法,该方法特异性较好,敏感性较高。