密码子优化的牛精蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以PCR的方法得到牛精蛋白基因的基因，去其内含子，得到牛精蛋白cDNA，克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PE，利用大肠杆菌偏好的编码精氨酸的密码子CGT将野生型牛精蛋白基因中编码精氨酸的稀有密码子（AGA或AGG）替换掉，通过基因合成得到密码子优化的牛精蛋白的基因，将其克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PS。将这两个表达载体分别转化入大肠杆菌表达菌株BL21中，经IPTG诱导，同样条件下，野生型牛精蛋白基因无法得到表达，密码子优化的牛精蛋白基因能够得到良好的表达，表达产物约占细菌总蛋白的18％，将表达蛋白纯化，进行DNA－蛋白结合实验，发现其能与DNA发生非特异性的结合。     

牙鲆生长激素基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)脑垂体总RNA中扩增出编码牙鲆生长素(GH)成熟肽基因序列。重组至融合表达载体pGEX-4T-3中,构建成牙鲆GH基因融合表达载体pGEX-gh,转化大肠杆菌BL21(DF3),筛选阳性克隆,IVIG诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示在45kD处有特异的蛋白条带出现,该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,3h达最高值,达到细胞总蛋白的18．3％。该融合蛋白在胞内主要以包涵体状态存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为牙鲆生长激素,并通过酶联免疫吸附受体法证实其具有生物学活性。     

离子强度对于牛精蛋白在大肠杆菌中的表达的影响

通过基因合成将大肠杆菌偏好的精氨酸密码子CGT取代野生型牛精蛋白基因中的稀有精氨酸密码子AGA和AGG，得到密码子优化的牛精蛋白基因，并将其克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PS。将这个表达载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21中，经IPTG诱导，可得到一33kD融合蛋白表达带，首次成功地将牛精蛋白在大肠杆菌中进行了表达，但其表达量很低，约为总菌体蛋白的13％。增加表遂菌株培养液的离子强度，可将蛋白表达含量提高到28％，且蛋白表达量与离子强度呈正相关。纯化后的牛精蛋白可在体外条件下与DNA发生结合。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

抗夏菌蛋白Rs—AFP2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响

为了研究遗传密码子对表达调控的影响，利用PCR重叠延伸法，对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变，构建突变体Rs-AFPm。序列分析表明，PCR产物全长240bp，有一个阅读框，编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成。突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比，在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA)，第5号氨基酸G1n相差一个碱基(CAG→CAA)，第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA)。重新合成引物，将切除信号肤的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b( )分别重组到大肠杆菌BL21菌株。IPTG诱导后，二者均得到了表达。软件分析显示，突变前pETAFPm表达产物占全菌蛋白的3％，突变后pETAFPo的表达产物占全菌蛋白含量的8％；表达蛋白主要以包涵体的形式存在，包涵体经超声波破碎后，蛋白质复性，抑菌结果表明，pETAFPm。表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比，已有效地提高表达量。     

重组人IL-6/IL-2融合蛋白的高密度发酵和纯化

克隆的IL-6/IL-2融合蛋白编码基因插入pBV220载体,转化BL21(DE3)菌株中表达。发酵过程中,30℃扩增生长6小时,42℃诱导培养4小时,控制溶解氧在30％～50％。发酵液中最终菌体密度(OD600)达29.17(相当于每升发酵液含55克湿菌体),表达的融合蛋白呈包涵体形式。表达蛋白占菌体总蛋白的30％左右。菌体经过超声破碎后反复洗涤包涵体,融合蛋白纯度达到70％,进一步用离子交换层析和凝胶过滤层析纯化使其纯度达95％以上。IL-6/2融合蛋白中的IL-6和IL-2活性分别为1×107和2×105 U/mg。重组人IL-6,/IL-2融合蛋白在大肠杆菌中达到了中试水平的高表达。     

枯草芽孢杆菌植酸酶基因在大肠杆菌中的表达及其对酶热稳定性的影响

采用PCR法,获得不含有信号肽序列的来源于枯草芽孢杆菌的植酸酶phyC基因的非融合和融合表达片段,分别构建带有T7lac启动子的大肠杆菌的植酸酶pET30NFphyC和pET30FphyC表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3)。大肠杆菌分别在30℃和25℃经IPTG诱导后实现了植酸酶的表达,非融合和融合植酸酶的表达量分别约占菌体总蛋白的13％和15％,分子量分别为40．13kDa和43．27kDa。表达产物具有植酸酶的生物学活性,非融合植酸酶和融合植酸酶的最适反应温度分别为50℃和75℃,经90℃处理10min,残留酶活性分别为37℃时的31．9％和75．7％。分析表明,含13个氨基酸残基的融合片段有助于植酸酶的表达和酶热稳定性的提高。     

植物选择标记基因hpt在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定

为对hpt基因编码蛋白进行的安全性评价，建立一种简便、高效的体外微生物表达体系，以获得大量的HPT蛋白，将用于植物转化的hpt基因的全编码序列克隆到原核表达载体pGEX4T-3上，在E．coli BL21中进行诱导表达，所得融合蛋白主要以包涵体的形式存在，且与Glutathione Sephrose 4B纯化介质的结合率不高。后经优化诱导表达的各种条件，成功地获得了可溶性的融合蛋白，该蛋白具有明显的生物活性。经Glutathione Sephrose 4B亲和层析，所得蛋白纯度＞95％。动物实验显示，融合蛋白还具有良好的免疫原性，免疫家兔后可诱导产生高滴度的抗体(＞1：10000)。ELISA及Western blotting检测进一步证实了所获纯化蛋白及其抗体的特性。这为深入进行HPT蛋白的安全性评价打下了良好的基础。     

八肋游仆虫一种富含谷氨酸的蛋白GARP的表达与纯化

为研究游仆虫中含有三核苷酸重复序列的GARP基因编码的GARP蛋白在细胞中的功能,利用定点突变技术,将GARP基因中的TGA突变为通用半胱氨酸密码子TGT.突变后的GARP基因构建于原核表达载体pRSETc中,得到重组质粒pRSETc-GARP,将pRSETc-GARP质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,带有纯化标签的重组蛋白His6-GARP获得可溶表达,表达产物与抗His抗体在约26 kDa处有很强的交叉反应.His6-GARP蛋白在不同pH条件下通过两次阴离子交换层析和一次凝胶层析三步纯化达到电泳纯.     

抗真菌蛋白Rs-AFP2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响

为了研究遗传密码子对表达调控的影响,利用PCR重叠延伸法,对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变,构建突变体Rs-AFPm.序列分析表明,PCR产物全长240bp,有一个阅读框,编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成.突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比,在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA),第5号氨基酸Gln相差一个碱基(CAG→CAA),第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA).重新合成引物,将切除信号肽的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b(+)分别重组到大肠杆菌BL21菌株.IPTG诱导后,二者均得到了表达.软件分析显示,突变前pETAFPo表达产物占全菌蛋白的3%,突变后pETAFPm的表达产物占全菌蛋白含量的8%;表达蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经超声波破碎后,蛋白质复性,抑菌结果表明,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径.这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比,已有效地提高表达量.     

Lagrange函数方向导数的简化表示

本文对n维欧氏空间中的极小化问题展开研究,讨论其Lagrange对偶的部分基本性质,得出了关于Lagrange对偶函数的两个新结果.首先证明在一般非空集合中,必定存在某一元素可用来表示该对偶函数在任何一点的方向导数;然后,在此基础上得到了相比一个原相关经典定理更单纯、更直接,集合所含元素为同类型次梯度的结果,从而将Lagrange对偶函数的方向导数表示进一步简化.     

A General Expression for the Electrometer Transfer Impedance

An expression for the electrometer transfer impedance Z21 is derived which describes the high-gain amplifier and the feedback network as general functions of the Laplace operator s. The equation derived is in the form of the general feedback equation, enabling the designer to employ the many tools of feedback analysis, such as root locus, Nyquist or Routh stability criteria, and Bode plots. Previous analyses have been limited to a constant forward transfer function and a feedback network employing a simple pole. Using this general analysis, the electrometer designer can take into consideration the unavoidable poles and zeros which are found in the forward transfer and feedback network. Furthermore, he can use this analysis to synthesize different desirable transform characteristics, thus optimizing electrometer design for a particular application.     

心肌组织特异性表达质粒的构建及表达

应用ＰＣＲ方法从大鼠基因组ＤＮＡ中扩增出心肌组织特异性顺式作用元件－－心肌肌钙蛋白Ｃ（Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｃ，ｃＴｎＣ）增强子／启动子序列，构建成ｃＴｎＣ启动子驱动ＬａｃＺ基因的真核表达质粒ｐｃＴｎＣβ。Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ和Ｉｎ Ｖｉｖｏ试验证明该调控元件能驱动外源性基因在心肌细胞中特异性表达。     

A method for Absolute Protein Expression Quantity Measurement Employing Insulator RiboJ

Measuring the absolute protein expression quantity for a specific promoter is necessary in the fields of both molecular biology and synthetic biology. The strength of a promoter is traditionally characterized by measuring the fluorescent intensity of the fluorescent protein downstream of the promoter. Until now, measurement of the absolute protein expression quantity for a promoter, however, has been unsuccessful in synthetic biology. The fact that the protein coding sequence influences the expression level for different proteins, and the inconvenience of measuring the absolute protein expression level, present a challenge to absolute quantitative measurement. Here, we introduce a new method that combines the insulator RiboJ with the standard fluorescence curve in order to measure the absolute protein expression quantity quickly; this method has been validated by modeling verification. Using this method, we successfully measured nine constitutive promoters in the Anderson promoter family. Our method provides data with higher accuracy for pathway design and is a straightforward way to standardize the strength of different promoters.     

间接测量函数的自适应建立方法

提出了一种用于间接测量系统的测量函数建立方法。它以n阶线性常系数微分方程的广义函数通解作为测量函数模型。根据系统的测量数据，从通解中自适应地确定与测量数据相吻合的测量函数表达式。并用一组数据建立的测量函数表达式证明，它是对测量数据更具有适应性的实用方法。     

动物乳腺组织高效表达通用型YAC载体的构建

以含有人α-乳白蛋白基因功能域的YAC(yeast artificial chromosome)为起始材料,构建了可以在动物乳腺高效表达外源基因的载体系统。根据已发表的人α-乳白蛋白基因序列,通过PCR的方法,扩增出了其5’端的837bp及3’端的1007bp片段,构建了整合型载体pRLA22。利用pRLA22在大肠杆菌中进行基因操作,可以将外源基因准确地置于乳白蛋白基因启动子控制之下。把重组的pRLA22导入含YAC的酵母菌后,高频率同源重组事件将会把外源基因插入YAC。本实验通过上述程序,将鸡的γ-干扰素基因cDNA序列导入了YAC。经过PCR检测,证明鸡的γ-干扰素cDNA序列已被重组到YAC的预定位置。因此,大肠杆菌载体pRLA22和含人的α-乳白蛋白基因的YAC,将构成能在动物乳腺高表达外源基因的有效载体系统。     

黑曲霉内切聚半乳糖醛酸酶A基因在大肠杆菌中的表达及产物酶学性质研究

采用Trizol法提取黑曲霉(Aspergillus niger JL-15)的总RNA,RT-PCR扩增到黑曲霉内切聚半乳糖醛酸酶A基因(pgaA),pgaA全长1113bp,编码370个氨基酸残基.pgaA经EcoRI和NotI双酶切,定向插入到表达载体pET-32a(+)中,并转化Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3),重组子经IPTG诱导,其表达产物(rePGA)果胶酶活性最高为637.0U/mg.酶学性质研究表明,rePGA的最适温度为60℃,热稳定性较差,最适pH为pH 5.0;Ca2+对其活性具有显著促进作用,而Fe3+和Mg2+对其活性具有显著抑制作用;SDS-PGAE结果表明,rePGA的相对分子质量约为40 500Da;rePGA的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)分别为4.05mg/mL和39.37μmol/(mL.min),rePGA能快速降低果胶溶液的粘度,符合其内切作用模式特点.