利用细胞工程筛选烟草抗赤星病突变体的研究——一种双层培养基筛选系统的建立

为有效筛选烟草抗赤星病细胞突变体,本研究建立了一种双层培养基筛选系统。即在下层培养基中接种烟草赤星病(Alternaria alternata),在上层培养基中接种烤烟品种 NC89和净叶黄的花药(NC89高感赤星病,净叶黄高抗赤星病)。在26±1℃培养40天后发现,NC89的花药出苗率和花药平均出苗数与对照(不接种赤星病的培养基)相比,分别由30%和53颗降到2%和12颗,而净叶黄的花药出苗率和平均出苗数基本没有变化。对筛选出来的 NC89花培突变体进行了田间赤星病抗性鉴定,其中80%对赤星病抗性较 NC89有所提高,甚至部分接近高抗。这说明该双层培养基系统可以有效地对抗烟草赤星病的细胞突变体进行筛选。本系统尤其适应于(1)需长期培养;(2)毒素不易制备或易失活的病原菌的抗性筛选。     

烤烟品种和打顶时期对赤星病抗性的作用

对生产上主要栽培的烤烟品种和抗源材料进行抗病性比较 ,结果表明 ,中烟 90、净叶黄、许金 4号抗病性较强 ,K32 6、G2 8属中抗品种 ,G140、NC89、红花大金元等为感病品种。通过烟株不同时期打顶试验 ,表明现蕾期打顶较盛花期打顶烟草赤星病发病重 ,差异达到极显著水平     

两个烟草赤星病抗源的遗传分析

以高抗赤星病烟草品种净叶黄(JYH)、Beinhart1000-1(Beinhart)和感病品种NC82为材料分别构建了2个杂交组合的P₁、P₂、F₁、F₂四世代群体,成熟期赤星病菌人工接种鉴定后,采用主基因+多基因混合遗传模型对JYH和Beinhart两个材料进行抗性分析,结果表明,两者的赤星病抗性均受两对加性-完全显性主基因+加性-显性多基因控制。组合1的加性效应以第1对主基因为主,且多基因的加性效应大于显性效应;组合2的两对主基因负向加性效应相等,且多基因的显性效应大于加性效应;2个组合F₂群体主基因遗传率分别为64.72%和63.88%,表明赤星病的抗性遗传以主基因效应为主,并且受环境影响较大。     

烟草赤星病发生与钾肥水平及品种间钾吸收能力的关系

本文调查了两个地点5个不同的钾肥用量水平的赤星病病情指数,分析了7个抗病性不同品种的含钾量,结果表明:(1)随钾肥用量水平增加,赤星病发病程度渐轻;高钾肥用量水平的烟株赤星病的发病程度显著低于低钾肥用量水平,但高钾肥用量水平间赤星病发生程度差异不明显;在根部施肥基础上于团探期、旺长期、平顶期喷施3次1%磷酸二氢钾,对于赤星病的减轻作用相当于高钾肥用量水平。(2)初步分析了7个对赤星病抗性不同的品种净叶黄、许金四号、Beinhart1000-1、G28、金星6007、G140、NC82烟叶含钾量,发现3个对赤星病抗性较强的品种烟叶中钾含量显著高于感病的3个品种,品种的抗性与钾含量间的相关系数R=0.8236,说明品种的抗赤星病能力与其对钾的吸收能力间可能有较强的相关性。      

烟草赤星病菌AT-毒素胁迫处理对种子萌发的影响及抗病性鉴定

为建立一种高效、准确鉴定烟草品种抗赤星病的方法,以4种不同抗赤星病的烟草品种为材料,研究了在不同浓度赤星病菌AT-毒素培养基上处理10、15、20 d对烟草种子萌发和根系生长的影响。结果表明,制备的AT-毒素原液中蛋白质、可溶性糖质量浓度分别为80.52μg/mL和23.39 mg/mL。随AT-毒素胁迫浓度的增大,烟草种子的发芽率和根系扎进培养基的株数比率均呈下降趋势。在一定AT-毒素浓度和胁迫时间范围内,不同品种对AT-毒素胁迫的耐受力表现出显著差异。在50%AT-毒素胁迫15和20 d时,抗病品种净叶黄根系扎进培养基中的株数比率分别为G28、YN116、红花大金元的1.18、1.75、6.02倍和1.02、1.75、5.52倍。综合分析,以烟草种子根系扎进培养基的株数比率作为鉴定烟草品种是否抗赤星病比发芽率更为准确,其最佳AT-毒素浓度为50%、最佳胁迫时间为15～20 d。     

一个与净叶黄抗赤星病基因紧密连锁的SSR标记

为了在分子水平上弄清烟草赤星病抗性的遗传规律,并进行遗传定位,以抗赤星病品种净叶黄和感赤星病品种NC82为亲本,构建了F₁、F₂、BC₁ 代群体。通过对该群体进行赤星病接种鉴定和抗性遗传分析,发现净叶黄对赤星病的抗性由显性多基因控制。通过分子标记群体扩增,在第M号连锁群上,筛选到一个与净叶黄的赤星病抗性基因紧密连锁的SSR标记,它与抗性基因间的遗传距离为4 cM。该标记可用于抗赤星病育种的辅助选择。     

“净叶黄”抗赤星病遗传规律的测定

净叶黄是从长脖黄的原始群体中途育出来的高抗赤星病种质，为进一步提高该种质的利用率，设置了正、反交，回交及自交试验。通过对其后代大量表现型的分析，摸清了净叶黄抗赤星病的遗传规律。初步结论：净叶黄抗赤星病受显性基因控制，抗病性已稳定，遗传力强，杂交成功率高，易于利用。与净叶黄杂交育成的品种，对赤星病均有一定的抗性。     

利用双层培养基筛选烟草抗赤星病突变体

在接种有赤星病菌(Alternaria alternata)的双层培养基上,成功地从高感赤星病烟草品种 NC89的花药中诱导出突变体苗,对这些突变体苗进行了离体抗病性鉴定,结果表明:其中70％的植株不同程度地表现赤星病抗性,部分表现高度抗性。     

Beinhart1000-1抗赤星病基因的QTL定位

为了研究赤星病抗性的遗传规律,筛选与抗性基因紧密连锁的SSR标记,并将抗性基因进行QTL定位,用抗赤星病品种Beinhart1000-1作母本,感病品种G140作父本,构建了F1及F2代群体,并对其进行了抗性鉴定和遗传分析。结果表明,Beinhart1000-1的赤星病抗病性是由显性多基因控制的。利用混合群体分组分析法,从2653对SSR引物中,得到83对在抗感池间表现多态且扩增条带稳定清晰的SSR标记。以F2代群体115个单株为作图群体,将该83对引物进行扩增,并用WinQTLCart2.5分析数据。这83个标记分别连锁到18个连锁群上,同时定位到两个抗赤星病的QTL位点,分别位于7号和15号连锁群上。      

毒素胁迫烟草抗黑胫病鉴定及抗性指标分析

为建立一种高效准确的烟草黑胫病抗性鉴定方法,以4种具有不同抗性特性的烟草品种为材料,研究培养基附加不同浓度黑胫病病菌毒素及不同胁迫时间对烟草种子萌发和根系生长的影响。结果表明,烟草黑胫病病菌毒素胁迫对烟草种子的发芽率和根系生长均有抑制作用,抑制效果随胁迫浓度的增加而增强,且不同品种对毒素胁迫的耐受力不同,利用体积浓度为50%的毒素胁迫15 d时,抗病品种G28、中抗品种YN116、中感品种净叶黄、感病品种红花大金元的根系长进培养基中的株数比率分别为79.38%、70.74%、33.55%和13.36%。初步确定鉴别烟草种子抗性特性的最佳粗毒素胁迫浓度为50%（即含蛋白质13.53μg/mL,含糖19.64 mg/mL）、最佳鉴定时间为胁迫15 d,利用该方法可在短期内高效准确地鉴定出不同品种（种质）对烟草黑胫病的抗感水平,加快烟草抗黑胫病育种进程。     

引进美国烤烟新品种(系)的抗性检测与评价

为选育和利用抗病品种、有效防治烟草病害,采用人工诱发抗性鉴定方法对引进的13个美国烤烟品种(系)进行了烟草黑胫病、烟草普通花叶病(TMV)和赤星病的抗性测定,并采用分子标记方法对黑胫病和TMV进行了辅助检测。结果表明:NCT5、NCT6、NCT7、NCT8、NCT9、NCT10和NCT13抗黑胫病,NCT1、NCT4、NCT11和NCT12中抗黑胫病,抗病分子标记辅助检测中仅有4个烤烟品种NCT6、NCT9、NCT12和NCT13检测出Ph基因,其余品种未检出含有Ph基因。NCT1、NCT8、NCT11和NCT4中感赤星病,NCT12、NCT10、NCT2、NCT13、NCT9、NCT3、NCT7、NCT6和NCT5中抗赤星病。NCT13、NCT10、NCT9、NCT12、NCT6、NCT4、NCT1、NCT2、NCT11、NCT7和NCT8感TMV,NCT5和NCT3中感TMV。PCR分析表明,所有供试品种(系)均不含N基因,与抗性鉴定结果中13个供试品种(系)对TMV均表现感病和中感的结果相吻合。      

恩施烟区烤烟黑胫病菌致病力测定及抗性品种差异鉴定

为有效进行恩施烟区烟草黑胫病的防控,本研究采用菌丝块茎基部创伤接种法鉴定了恩施烟区烟草黑胫病菌的致病力。根据黑胫病菌菌株接种K326、红花大金元、云烟202后的AUDPC （病害流行曲线下面积）数值进行了聚类分析,将恩施烟区烟草黑胫病菌划分为I、Ⅱ、Ⅲ 3种致病型。3种致病型病原菌没有表现出典型的强、中、弱致病特性。7个抗性烟草品种对不同致病型黑胫病菌表现出抗性差异,革新3号对3种致病型菌株均表现出较好的抗性。     

烤烟不同间作对烟草黑胫病防控效果的影响

为选择适宜的烤烟间作防控烟草黑胫病,通过田间试验研究了烤烟间作花生、黑麦草、大蒜对土壤烟草黑胫病菌数量、病情指数和防治效果的影响。结果表明,烤烟不同间作的土壤烟草黑胫病菌数量和病情指数趋势相同,均表现为烤烟间作大蒜<烤烟间作黑麦草<烤烟间作花生<烤烟单作,对烟草黑胫病的防控效果表现为烤烟间作大蒜>烤烟间作黑麦草>烤烟间作花生。烤烟间作大蒜对烟草黑胫病的防控效果显著较好。     

二氢茉莉酸丙酯对烟草黑胫病的控制作用及对osmotin基因表达的影响

二氢茉莉酸丙酯(PDJ)对烟草黑胫病的控制及其对osmotin基因表达有影响。PDJ处理可显著减轻烟草幼苗黑胫病的病情,用量为100mg/L时,控制效果可达69.57%,持续时间大约在15d;另外,PDJ诱导了烟草幼苗osmotin基因的表达,接种烟草黑胫病菌也可以诱导此基因表达,和不处理接种烟草比较,PDJ处理后接种的烟草osmotin基因表达强烈且时间长。      

两株烟草根际拮抗菌的生防和促生效果研究

使用植物根际促生细菌(PGPR)来防治土传病害是目前生物防治的研究热点。在温室内进行盆栽试验以研究从烟株根际筛选出的两株生防细菌对烟草黑胫病的防治和促生效果,试验设4个处理,分别为接种生防菌YC0573、YC0136、药剂对照(甲霜灵锰锌)和发病对照。结果表明,温室条件下YC0573和YC0136的防治效果分别达到90.9%和95.4%,均高于甲霜灵锰锌(86.4%);接种生防菌的烟株生长状况明显好于对照烟株。对不同生长期烟株叶片叶绿素含量、电解质相对渗透率以及超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化氢酶等系统抗性相关指标进行测定,结果显示,两株拮抗菌可诱导烟株产生系统抗性(ISR),增强对病害的防御力,并且能有效防治烟草黑胫病,促进烟株生长,具有良好的应用潜力。     

烟草黑胫病抗性遗传分析

选用中烟90(高抗),革新3号(高抗)、L8(中抗)、Burley21(中抗)、KBM20(高感)、KY14(高感)等6个烟草品种作为杂交亲本,按Griffing双列杂交的第1种方法设计36个杂交组合.用DPS数据处理系统对烟草黑胫病病情指数的配合力和遗传力进行了分析,结果表明,不同品种、不同组合问抗病性存在极显著差异,不同亲本抗病性能稳定表现出来.6个品种间黑胫病的一般配合力和特殊配合力存在极显著差异,一般配合力效应分析,中烟90为第一负效应,KBM20为第一正效应,说明中烟90在黑胫病抗性育种中有较好的潜力,KBM20不利于黑胫病抗性育种,6个品种年度间一般配合力表现有一定的差异,主要是在亲本Burley21上,中烟90、革新3号一般配合力表现比较稳定,为黑胫病抗性高值亲本,较适宜作为黑胫病抗性亲本来源,Ky14、KBM20一般配合力表现为低值亲本,不适宜作为抗黑胫病抗性来源的亲本;杂交组合Burley21和KBM20特殊配合力较高,抗性上有进一步研究利用价值.烟草黑胫病遗传以显性效应为主,加性效应也较大,抗性表达还受环境影响.黑胫病抗性遗传规律稳定,亲本抗性对后代影响较大,但在早世代进行抗性改良效果不好.     

白肋烟两个DH群体的构建与染色体倍性的鉴定

分别采用气孔保卫细胞叶绿体计数和流式细胞仪两种方法,鉴定了白肋烟烟碱含量和抗黑胫病两个杂交组合的杂种F₁代经花药培养获得的再生植株的染色体倍性,结果发现叶绿体计数法可以简单经济地检测烟草花药培养再生植株的染色体倍性,但由于受混倍体植株的影响,鉴定结果的准确性较低。流式细胞仪则更加简便快速而且准确地鉴定出各种染色体倍性的再生植株,鉴定结果与开花结实情况完全一致。在此基础上构建了可用于白肋烟烟碱合成代谢和抗黑胫病遗传研究及基因定位的两个双单倍体(DH)遗传群体。      

黑胫病菌在烟草品种间的侵染差异及I-S关系研究

1997～1999年在田间通过人工接菌方法比较了12个烟草品种间黑胫病菌侵染差异.结果表明,属高度感病的品种有K394、云烟85、红大;属中等程度偏感病的品种有贵烟11、Nc89;属中等程度感病如VA116、Nc37NF、K358、Rg11;属中等抗病有K346、Nc82;高抗病类型有coker371.对烟草黑胫病根茎部发病情况进行系统调查,获得12个品种的普遍率与严重度间对应关系数据,并且分析了两者的关系(I-S关系).结果表明,寄主生育阶段影响烟草黑胫病的I-S关系.各品种前期病株率不能真实反映各品种感病程度的差异,以中后期的病情指数为标准比较品种间抗感染程度较为适宜.不同品种的I-S关系均可用直线方程描述.     

烟草黑胫病菌分子生物学研究进展

烟草黑胫病是烟草主要病害之一,每年给烟草生产造成巨大损失。烟草黑胫病菌隶属于卵菌纲疫霉属。近十几年来随着分子生物学技术的迅猛发展,烟草黑胫病菌的分子生物学研究有了较大进步。本文总结了烟草黑胫病菌在病原菌起源和分类命名、全基因组序列、线粒体基因组序列和功能基因等方面的研究进展,并分析了烟草黑胫病菌在分子生物学研究方面的未来发展方向,以期为烟草黑胫病菌致病机理研究和烟草分子抗黑胫病育种提供一定的参考。     

申嗪霉素对烟草黑胫病的毒力及防治效果

为探明申嗪霉素防治烟草黑胫病的潜力,在室内离体条件下测定其对烟草黑胫病菌菌丝生长、孢子囊形成和游动孢子释放的毒力,并通过温室盆栽和大田药效试验明确其对烟草黑胫病菌的防效及对烟草生长的影响。结果表明,申嗪霉素对沂水烟区黑胫病菌孢子囊的形成和游动孢子的释放抑制效果最好,EC₅₀值分别为0.31和0.35 μg/mL。室内防效结果表明,1%申嗪霉素悬浮剂（15 g a.i./hm²）对烟草黑胫病的防效为84.37%,显著高于25%甲霜灵可湿性粉剂（56.33%）和50%烯酰吗啉可湿性粉剂（80.55%）,而田间药效试验结果与室内防效基本一致,在冕宁和诸城两地1%申嗪霉素田间防效分别为90.49%和82.93%,显著高于对照药剂甲霜灵（71.89%,38.87%）和烯酰吗啉（78.42%,69.01%）。除此之外,申嗪霉素较甲霜灵和烯酰吗啉在提高株高、茎粗、有效叶片数及光合速率等指标效果更好。可见,申嗪霉素是防治烟草黑胫病的有效制剂,可作为甲霜灵和烯酰吗啉的轮换药剂使用。