武汉肉类食品中大肠杆菌O157∶H7分离株stx亚型和毒力特征分析

从22 家市场销售的117 份肉类食品中分离出4 株大肠杆菌O157∶H7菌株,经PCR检测这4 株菌的stx、hly、 eae毒力基因均为阳性。采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法对这4 株菌的stx亚型进行鉴定。 3 株菌同时携带stx1、stx2基因,且均为stx1a、stx2a亚型。菌株EC5.11仅携带stx2基因,但在所有的stx2分型PCR反 应中都为阴性。用PCR扩增该菌株stx2基因全长并克隆测序,序列分析结果表明EC5.11志贺毒素基因为stx2c亚型。 采用Vero细胞毒性实验检测这4 株菌产志贺毒素的状况,结果显示这些菌株都具有一定的Vero细胞毒性。     

食品中大肠杆菌O157∶H7疑似菌株的分离和鉴定研究

采集117份食品样品,经过PCR扩增毒力基因stx1、stx2和O157特征基因rfbO157初筛。将部分PCR阳性的食品样品,经过新生霉素EC增菌液增菌、免疫磁珠富集、血清学鉴定、菌落PCR复筛,分离出5株O157:H7疑似菌株。其中1株O157∶H7疑似菌株EC5.11不能与O157诊断血清产生良好凝集反应,采用血清学方法该菌容易漏筛。采用PCR扩增rfbO157基因和H7鞭毛抗原编码基因fliCH7,EC5.11均呈阳性反应。最终包括EC5.11在内的4株疑似菌株被证实为O157∶H7血清型。本研究提出了一种改良方法筛选、鉴定食品中O157∶H7疑似菌株,比起传统方法,减少工作量的同时提高了筛选的特异性。     

肠出血性大肠杆菌变种的RAPD分型研究

对4株肠出血性大肠杆菌(EHEC)进行随机扩增多态性(RAPD)分析,并结合主要毒力基因如eae和hly,以及志贺毒素滴度,探讨RAPD实验对大肠杆菌致病菌进行基因分型结果的可靠性。实验菌株中有两株变种携带stx基因但不能正常表达志贺毒素,其中一株变种EC169与另两株正常表达志贺毒素的O157菌株具有相似的扩增图谱,而另一株非O157变种EC130与其他菌株聚类明显不同。从20条随机引物中筛选出了重复性强且具有多态性的随机引物G2、G7、G8、G11、G12,可用于大肠杆菌致病菌快速鉴别和食物中毒溯源。     

食品中非O157大肠杆菌志贺毒素基因序列分析

对一株从食品中分离的非O157产志贺毒素1型大肠杆菌(EC6)进行研究。将该菌株所产志贺毒素Stx1用 PCR扩增stx1 基因全长并克隆测序,其stx1 基因与GenBank 数据库收录的stx1 基因最高同源性为99%,表明EC6 发生了一定程度的基因突变。采用邻位相连法构建进化树,结果表明EC6 为stx1 基因亚型。     

产志贺毒素突变株的毒力分析

对2株食物中毒病人体内分离的产志贺毒素突变株EC130和EC169进行毒力分析。EC130和EC169携带stx基因但不能正常表达志贺毒素,具有eae基因和hly基因,仍具有一定毒力。初步探讨了产志贺毒素突变株不能正常表达志贺毒素的机理,高产志贺毒素的对照株携带Q933基因,而EC130和EC169不携带Q933基因。结果表明,单一采用志贺毒素作为检测靶标,容易造成产志贺毒素突变株漏检,今后在检测食品中产志贺毒素株时应增加检验eae基因和hly基因。     

蔬菜中大肠杆菌O157的分离与鉴定

对武汉市售蔬菜(50份)进行大肠杆菌O157的检验,经过新生霉素-EC增菌液增菌、免疫磁珠富集、选择性平板培养和血清学鉴定,从一份生菜中筛出1株O157阳性菌株EC9.23。PCR鉴定该菌毒力基因,stx1、stx2、rfbO157基因均为阳性,hly、eae、fliCH7基因均为阴性。说明从武汉市售蔬菜中可检出携带志贺毒素基因的O157菌株。     

检测产志贺毒素大肠杆菌的菌落PCR方法

针对产志贺毒素大肠杆菌的毒力基因stx 设计特异性引物,并建立一种菌落PCR 方法。菌落PCR 模拟实验证实,该方法特异性强,能良好的扩增出O157 的stx1 和stx2 基因,而普通大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌则无PCR 扩增产物。应用分子检测初筛、选择性培养、菌落PCR 相结合的方法,检测实际食品样品,分离检测到一株携带 stx1 的产志贺毒素大肠杆菌。本实验建立的菌落PCR 方法可应用于食品检验。     

基于免疫磁分离的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的评价

目的 研究基于免疫磁分离的七种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的灵敏度与特异性。方法 将大肠埃希氏菌O157：H7和大肠埃希氏菌O103不同稀释度的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及O157:H7和O103的抗原基因。同时,对菌悬液进行活菌计数,进行灵敏度研究。对8株携带stx1、stx2、eae基因的目标菌菌悬液,以及25株非目标菌的标准菌株及分离菌株的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及抗原基因,进行特异性研究。结果 本方法检测大肠埃希氏菌O157：H7的stx1、stx2、eae以及抗原基因的灵敏度为10_²CFU/mL,检测大肠埃希氏菌O103抗原基因的灵敏度为10_³CFU/mL. 8株目标菌检测结果与其携带的基因一致,没有假阴性,包容性达到100%。25株目标菌检测结果与其携带的基因一致,未发现有假阳性,排他性达到100%。结论 方法具有良好的灵敏性及特异性,适用于食品中七种产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速检测。     

食源性产志贺毒素大肠杆菌的分离及菌株特征分析

了解不同食品中产志贺毒素大肠杆菌的流行情况、菌株特征及潜在致病性。方法 对我国不同地区采集的355份食品样品进行产志贺毒素大肠杆菌分离鉴定,对菌株进行stx1/stx2基因分型、eae等毒力基因检测,并对菌株进行多位点序列分型(MLST)分析。结果 355份样品中44份stx2基因阳性,共分离出11株非O157 产志贺毒素大肠杆菌,其中3株携带stx2a亚型,3株携带stx2e亚型,1株携带stx2b亚型,4株不能分型;5株携带ehxA、saa毒力基因,2株携带subA基因,1株携带katP基因;MLST将11株菌分为7个不同的ST型,存在与溶血性尿毒综合症患者肠出血性大肠杆菌分离株(HUS-associated enterohemorrhagic E.coli,HUSEC)及主要流行血清群产志贺毒素大肠杆菌亲缘关系较近的ST型别。结论 我国食品中存在一定程度的非O157产志贺毒素大肠杆菌污染,部分菌株具有潜在致病性,应加强对食品中STEC的监测。     

牛源性非O157大肠杆菌的分离与鉴定

目的:对牛粪及牛肉中的非O157大肠杆菌进行分离、鉴定和毒力基因携带情况进行检测,以了解非O157大肠杆菌的污染状况。方法:参考USDA检测方法,对样品进行选择性增菌,用多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法进行初步筛选,检测O抗原(O157、O121、O111、O103、O26),阳性样本用选择性显色培养基rainbow agar分离纯化,可疑菌株用多重PCR方法鉴定O抗原,PCR-限制性片段长度多态性鉴定H抗原,并采用血清凝集实验进行验证,确认的阳性菌株采用多重PCR方法进行毒力基因(stx1、stx2、eae、hly)检测。结果:在153份牛粪和49份牛肉样本中,共40份样品检出1个或多个O血清型阳性,牛粪检出率高于牛肉,非O157阳性率为19.3%,O157的阳性率为0.50%;经分离纯化后,共鉴定出阳性菌株30株,其中O26最多占73.3%,O121、O103、O157分别占16.7%、6.7%、3.3%。毒力基因检测结果显示,分离自牛肉的2株O26:H11,一株stx1、hly阳性,另一株hly阳性,分离自牛粪的1株O26:H11携带hly基因,因此30株菌株中带毒菌株阳性率为10.0%,非O157产志贺毒素大肠杆菌阳性率为3.4%。结论:牛粪和牛肉中非O157大肠杆菌的污染率明显高于O157,尤其是O26:H11血清型最高,且检出含志贺毒素基因的大肠杆菌,这提示零售牛肉市场存在非O157大肠杆菌污染的安全风险,我国应该加强对非O157大肠杆菌的检测和监控。     

4 株E. coli O157:H7毒力基因检测及其冷应激损伤

采用多重聚合酶链式反应对4 株大肠埃希氏菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）进行毒力特性评价,研究3 种常用选择性生长基质对E.coli O157:H7的精确定量对比,筛选出的适宜选择性培养基用于冷应激时菌体损伤的研究。结果显示,菌株CICC 21530的stx1、stx2、eae基因均为阳性,NCTC 12900和牛肉分离菌1的eae呈现阳性,牛肉分离菌2三种毒力基因均为阴性,表明4 株菌的致病性不同;4 株测试菌在改良山梨醇麦康凯琼脂（cefiximetelluritesorbitol macconkey agar,CT-SMAC）上计数均显著低于胰蛋白胨大豆琼脂（tryptose soya agar,TSA）上计数（P＜0.05）,而SMAC和改良伊红美蓝琼脂（modified eosin methylene blue agar,mEMB）上的计数与TSA相比无显著性差异,表明改良SMAC对正常菌体既有较强抑制作用,不适合用于E. coli O157:H7的精确计数,可以选用SMAC或mEMB;进一步以SMAC和mEMB作为选择性培养基研究菌体在4 ℃冷应激时的损伤情况,结果表明冷藏过程中SMAC、mEMB及TSA上的菌数均逐渐下降,第10天时4 株菌均发生了一定程度的损伤或死亡。本方法可为食品安全中E. coli O157:H7的定量评估和风险控制提供科学依据。     

食品中大肠杆菌O157的PCR检测与wzy基因的测序分析

大肠杆菌O157:H7 和O157:H- 是重要食品致病菌。从食品中分离得到一株O157:H7 菌株EC5。将该菌株PCR 扩增wzy 基因全长并克隆测序。结果表明,wzy 基因序列与大肠杆菌O157:H7 标准株EDL933 有100% 同源性。从NCBI GenBank 数据库下载O157 菌株wzy 基因序列,针对保守序列设计引物并扩增O157 菌株和非O157 菌株。PCR 结果表明,wzy 基因特异性强,可作为检测O157 菌株的标志基因。本研究为开发大肠杆菌O157 的分子检测技术提供新的研究思路。     

Escherichia coli O157 and non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli in fecal samples of finished pigs at slaughter in Switzerland

Fecal samples from 630 slaughtered finisher pigs were examined by PCR to assess the shedding of Escherichia coli O157 (rfbE) and Shiga toxin-producing E. coli (STEC, stx). The proportion of positive samples was 7.5% for rfbE and 22% for stx. By colony hybridization, 31 E. coli O157 and 45 STEC strains were isolated, and these strains were further characterized by phenotypic and genotypic traits. Among E. coli O157 strains, 30 were sorbitol positive, 30 had an H type other than H7, and none harbored stx genes. Intimin (eae), enterohemolysin (ehxA), EAST1 (astA), and porcine A/E-associated protein (paa) were present in 10, 3, 26, and 6% of strains. Among them, one eae-gamma1-positive O157:H7 strain testing positive for ehxA and astA and two eae-alpha1-positive O157:H45 strains were classified as enteropathogenic E. coli (EPEC). The O157:H45 EPEC harbored the EAF plasmid and the bfpA gene, factors characteristic for typical EPEC. The isolated STEC strains (43 sorbitol positive) belonged to 11 O:H serotypes, including three previously reported in human STEC causing hemolytic uremic syndrome (O9:H-, O26:H-, and O103:H2). All but one strain harbored stx2e. The eae and ehxA genes, which are strongly correlated with human disease, were present in only one O103:H2 strain positive for stx1 and paa, whereas the astA gene was found more frequently (14 strains). High prevalence of STEC was found among finisher pigs, but according to the virulence factors the majority of these strains seem to be of low virulence.     

温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7污染状况调查

目的调查温州市食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的污染状况,了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力因子的携带与耐药情况。方法采用分层随机抽样的方法,对2008—2011年抽取的231份食品样品,用免疫磁珠富集法对大肠杆菌O157∶H7进行分离,对该分离株进行生化、血清学鉴定,以纸片法(K-B法)进行药敏试验;采用PCR方法检测O、H抗原基因和stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因。结果 231份样品中,分离出1株肠出血性大肠杆菌O157∶H7,检出率为0.43%;O157抗原和H7抗原的核酸检测结果阳性,但未检测到stx1、stx2、eaeA、hlyA等4种毒力基因,菌株对红霉素、利福平、150μg/片和10μg/片两种浓度的0/129(二氨基二异丙基喋啶磷酸盐)耐药。结论温州市食品中存在大肠杆菌O157∶H7的污染,检出率较低,但提示要加强主动监测,通过有效干预,防范肠出血性大肠杆菌O157∶H7所致食源性疾病的发生。     

Fecal shedding of Escherichia coli O157, Salmonella, and Campylobacter in Swiss cattle at slaughter

Fecal samples from 2,930 slaughtered healthy cattle were examined with the following goals: (i) to monitor the shedding of Escherichia coli O157, Salmonella, and Campylobacter in cattle; and (ii) to further characterize the isolated strains. The percentage of the 2,930 samples that tested positive for E. coli O157 by PCR was 1.6%. Thirty-eight strains from different animals that agglutinated with Wellcolex E. coli O157 were isolated. Of the six sorbitol-negative strains, five tested positive for stx2 genes (two times for stx2c and three times for stx2), and one strain tested positive for stx1 and stx2c genes. All sorbitol-negative strains belonged to the serotypes O157:H7- and O157:H7 and harbored the eae type gamma 1 and ehxA genes. The 32 sorbitol-positive strains tested negative for stx genes and belonged to the serotypes O157:H2, O157:H7, O157:H8, O157:H12, O157:H19, O157:H25, O157:H27, O157:H38, O157:H43, O157:H45, and O157:H-. All O157:H45 strains harbored the eae subtype alpha 1 and therefore seem to be atypical enteropathogenic E. coli strains. Whereas none of 1,000 examined samples was positive for Salmonella, 95 of 935 (10.2%) samples were positive for Campylobacter, and all strains were identified as C. jejuni. Sixteen Campylobacter strains were resistant to tetracycline, five were resistant to nalidixic acid/ciprofloxacin, four were resistant to streptomycin, and one was resistant to nalidixic acid/ciprofloxacin and streptomycin. Fecal shedding of zoonotic pathogens in slaughter animals is strongly correlated with the hazard of carcass contamination. Therefore, the maintenance of slaughter hygiene is of crucial importance.